聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction,PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。
PCR原理:
PCR由變性、退火和延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)高溫（95℃左右）加熱一定時(shí)間后，使其解離成單鏈，以便它與引物結(jié)合；
②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：將溫度降至55℃左右時(shí)，引物與模板DNA單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合；
③引物的延伸：再將溫度調(diào)至72℃左右（DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度），DNA模板和引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，沿著磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。這樣經(jīng)變性、退火和延伸重復(fù)若干個(gè)循環(huán)后，就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
1、變性溫度與時(shí)間：
變性溫度低，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。
2、退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：
退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20 個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間*結(jié)合。
3、延伸溫度與時(shí)間： Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子
70℃ 60 核苷酸/S/酶分子
55℃ 24 核苷酸/S/酶分子
高于90℃時(shí)， DNA 合成幾乎不能進(jìn)行。
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb 需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。
