ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗是目前最常用的免疫學檢驗方法，由于其試劑穩(wěn)定，易保存，操作簡便，結果判斷較客觀，既適宜于大規(guī)模篩查試驗，又可用于少量標本的檢測，既可以做定性試驗也可以做定量分析，目前已廣泛用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和細胞因子檢測等領域。ELISA有敏感性高，特異性強，重復性好的特點，但其同時存在影響因素多的不足。
現(xiàn)就實驗操作中常見的影響因素進行分析實驗，以提高的實驗質量。
1、樣品
樣品是檢測的前提，樣品質量會直接影響實驗結果。可以用ELISA來檢測的樣品很多，根據(jù)檢測項目不同可以是血清、血漿、唾液、尿液等，但大部分還是以血清為樣品。作為血清樣品，應避免溶血，溶血可能會增加非特異性顯色，導致結果出現(xiàn)誤差。
血清樣品的反復凍融會使血清中的抗體效價下降，所以需要多次檢測的血清樣品，如在5d內檢測完，可4℃保存，如需長時間檢測，可進行分裝凍存。樣品如被細菌污染腐敗，可能會導致假陽性。
2、溫度
溫度主要影響抗原抗體反應，酶促反應速度及非特異性吸附，溫度升高可使抗原抗體結合反應加速，但也易引起抗原抗體復合物的解離。酶促反應速度同樣隨溫度升高而增快，但是酶蛋白變性也加快，喪失酶學活性，降低酶的有效濃度而減慢反應速度，溫度低時以前者為主，高時以后者為主。
溫度是質量控制的一個重要方面，一般允許±1℃的誤差。最好水浴，微孔板浮在水面，使溫度迅速平衡。如放溫箱內溫育，微孔板不應疊置，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，盛放微孔板的濕盒應是金屬的，傳熱容易?？諠窈袘A先放在溫箱中，以平衡溫度，在室溫較低時更需要。
3、時間
在溫度保證的前提下，時間的控制至關重要，尤其是底物顯色的時間控制，顯色時間不足或過長會導致實驗不成立，無法對檢測結果進行判斷。
加人標本、試劑及混合的時間稱為操作時差。操作時差在每個試驗中都存在，對結果或多或少有影響。對手工操作，尤其是樣品量大的項目，從加人第一個標本到最后一個標本，需幾十分鐘，加人試劑及混勻存在很大的時間差異，使抗原抗體和酶促反應時間不一致，易產(chǎn)生假陽性、假陰性結果。
因此，樣品過多時，請選擇分批操作，對勿須更換移液口吸嘴的酶結合物，底物的加樣可選擇8聯(lián)或12聯(lián)專用的多道加液器。亦可避免單孔滴加底物時遺漏多加。
4、人員操作
ELISA成品試劑盒為檢測工作提供了方便，按照說明書進行操作就可以完成實驗，但人為操作時候很多細節(jié)也會導致實驗誤差。
1）. 包被
一些ELISA反應板需要自行進行包被處理，沒有進行包被，或包被液使用與檢測項目不同都會使實驗失敗。包被時，未進行震蕩，孔底未被包被液全部覆蓋會導致檢測結果偏差。
2）. 反應液稀釋
稀釋液使用錯誤或稀釋比例不正確會導致實驗失敗或結果不準確。
3）. 洗板
人工洗板時，棄去洗滌液時方法不當，易使各孔液體相互流入，導致假陽性；洗滌液使用量和洗滌次數(shù)過少導致洗滌不徹底，洗板后未拍板或拍不干凈都會影響實驗結果。
5、設備
儀器設備是ELISA實驗的基礎，常用的相關儀器設備包括移液器、酶標儀、洗板機和恒溫箱等。所有設備都需要進行檢驗校準，保證準確性和精確度。
移液器的使用要盡可能選擇所需加液量接近最大量程，并正確使用，減少實驗誤差。
酶標儀要提前開機預熱，保證光源穩(wěn)定；洗板機要檢查加液孔是否通暢，保證加液量。
恒溫箱要提前開機，開、關門要快速，保證反應溫度。
6、試劑
試劑盒要根據(jù)要求進行保存，并保證在有效期內使用，使用前應平衡到室溫。新購入的試劑盒要進行校驗，檢查實驗是否成立，不同的試劑盒或不同批號的試劑不可混用。
7、顯色
顯色是ELISA中的最后一步反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。
在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延。
8、其他
封板膜封閉不嚴或開啟時孔內液體蒸發(fā)、震出可導致各孔相互污染；操作時接觸到ELISA板底導致透光度改變，影響酶標儀測量結果；
加樣圖省事，未認真更換移液器吸頭，認為其帶入標本殘留量小，不易影響結果，是部分檢測人員常有的心理。因此加標本時必須認真更換移移液器吸頭，防止移液器吸頭殘留痕量產(chǎn)生假陽性結果。加樣時應防止濺出污染其它標本。
9、比色測定
ELISA的比色測定由酶標儀進行測定，故需強調比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否是雙波長（450nm和630nm）。
