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        PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過(guò)DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級(jí)別。PCR驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。

PCR技術(shù)原理：
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。
在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。

下面一起了解提高PCR反應(yīng)結(jié)果成功的參考技巧：
1、將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。 
2、當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動(dòng)"開始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。 
3、不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。
4、對(duì)于有問(wèn)題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。
5、沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無(wú)MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。 
6、泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。 
7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。 
8、檢查模板和引物的用量。 
9、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。 
10、泳道中出現(xiàn)模糊條帶： 減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過(guò)68℃。 重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物。 
11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時(shí)不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。
12、基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA的長(zhǎng)度。DNA片段長(zhǎng)度可以超過(guò)50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。要擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請(qǐng)查閱高分子量DNA提取操作過(guò)程相關(guān)文獻(xiàn)。降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長(zhǎng)度一般為24~34個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來(lái)增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。
13、變性：第一步變性在94℃下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過(guò)程中盡可能縮短變性時(shí)間（94℃下進(jìn)行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長(zhǎng)度超過(guò)12 kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。 
14、延伸：68--72℃下進(jìn)行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無(wú)此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)間用10分鐘替代原來(lái)的8分鐘。長(zhǎng)片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個(gè)突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。測(cè)序時(shí)因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。 
15、引物設(shè)計(jì)： 一般長(zhǎng)度20-30bp； 至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)； 引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。

注意事項(xiàng)：
1、加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
2、使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
3、按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
4、底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
5、洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
6、使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器 。
7、實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
8、試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
9、不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。