ELISA 即酶聯(lián)免疫吸附測定，是一類常用的免疫酶技術(shù)。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，然后利用酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的抗體或抗原與之孵育，加入顯色劑顯色，通過酶標(biāo)儀測定待測物顏色與標(biāo)準(zhǔn)物顏色的差異，繪制出酶活曲線得出待測物濃度。
優(yōu)化ELISA的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在最后一步產(chǎn)生信號。而不充分的洗滌會導(dǎo)致差異和高背景，從而帶來不理想的結(jié)果。下面將為你介紹一些利用自動洗板機(jī)來洗滌ELISA平板的技巧。
免疫分析，比如ELISA，一般包含兩個或以上的孵育步驟，中間以洗滌隔開。ELISA通常在96孔板中開展，其上包被了結(jié)合抗原或抗體。在封閉步驟后，包被后的平板首先與一抗或抗原孵育。隨后通過一些洗滌步驟去除未結(jié)合（低親和力）的抗原-抗體復(fù)合物。接著，平板與二抗孵育。這種帶有酶的抗體與高親和力的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。之后，又是一輪洗滌。最后是添加底物并檢測信號。
我們可使用多種底物來檢測最終的抗原-抗體復(fù)合物。底物分為三類：自然發(fā)光、化學(xué)發(fā)光和熒光。準(zhǔn)確說來，ELISA這個詞指的是使用自然發(fā)光底物的分析。而使用化學(xué)發(fā)光底物的分析被稱為Luminescent Immunoassay（LIA），使用熒光二抗的分析被稱為Fluorescent Immunoassay（FIA）。
1、洗滌參數(shù)：
第一個主要的參數(shù)是洗滌量。自動洗板機(jī)會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調(diào)為高，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。
ELISA板的制造商通常會在試劑盒的使用手冊中列出包被量。行業(yè)中通常使用的包被量是200μl。如果你的試劑盒也是這樣，那么制造商可能會建議使用300μl洗滌液進(jìn)行洗滌，以便清潔整個反應(yīng)孔的壁。一般來說，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
2、洗滌次數(shù)：
第二個影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量。當(dāng)然，洗滌次數(shù)越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會降低信號強(qiáng)度，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過，ELISA板的制造商會對洗滌次數(shù)提出建議。一般而言，制造商包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。
控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說，96孔板的每個孔能容納330至460 μl。不過，有些自動化洗板機(jī)可設(shè)置程序，分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢？其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量，但不會溢出到其他孔中。
3、抽吸：
另外，還有一些參數(shù)會影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整，以降低背景（殘留量）和差異。
殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體，它們會增加背景信號。殘留量越小，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。
吸液高度會明顯影響殘留量；如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會使吸液效率降低，殘留量增加。
目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復(fù)雜，因為你需要非常仔細(xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實驗室使用幾種不同的板，那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時，吸頭會降到反應(yīng)孔的底部。調(diào)整高度就不是很重要，因此洗頭會下降到底部。
抽吸的位置也對殘留量有著重要影響；如果每個孔只使用一個抽吸點（這很常見，因為更快），那么抽吸的位置需要優(yōu)化。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間，即使這是所有洗頭最常見的默認(rèn)位置。一般來說，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。
反應(yīng)孔的形狀也會影響殘留量。C形底（平底圓角）的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。
如果沒有自動洗板機(jī)，采用手工洗滌，那么也需要注意幾點。使用8道或12道微量移液器，采用倒吸的方法進(jìn)行洗滌；不同廠家的洗液不宜相互混用。洗板時需保證微孔板平放，將洗滌液注滿各孔，但盡量避免漏液yi液，以每孔300 μl為宜；板洗次數(shù)一般為3次，要保證洗板的浸泡時間，每次浸泡時間一般為30-60 秒；盡量減少洗液殘留量，推薦每次洗板后進(jìn)行拍板，并及時更換吸水紙，避免吸水紙的碎屑粘到反應(yīng)孔內(nèi)。
ELISA看起來很簡單，但是在實際操作過程中，也不能掉以輕心，還是應(yīng)該仔細(xì)檢查洗滌步驟，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。
PCR反應(yīng)之引物二聚體解讀
聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，是一種非常強(qiáng)大的技術(shù)，可以通過一種非常簡單但是高效的方法來復(fù)制DNA，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計，酶的質(zhì)量。模板的制備，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下，PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的產(chǎn)量。
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細(xì)胞組份，溶解細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實驗用。但近幾年來也發(fā)展了些 簡便實用較為有效的標(biāo)本消化處理方法。亦可滿足PCR實驗的要求。采用哪種方法消化 處理標(biāo)本，視PCR實驗的目的(是科研還是檢測)及環(huán)境條件而定。
模板核酸的提取制備方法:
一、蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標(biāo)本的消化處理，尤以DNA樣品為佳。如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿，糞便等。
1、試劑配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，臨用時加入消化液中。
2、提取方法:
有些標(biāo)本、在用蛋白酶K消化前，還需預(yù)處理一下，如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等。
臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻，55℃1～3小時， 或37℃過夜。加等體積的飽和酚抽提1～2次，再加等體積的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液，加入2.5倍體積的冰冷無水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別小心的 吸棄或倒掉上清，真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴(kuò)增，或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本，經(jīng)離心處理 后，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增。 如雜質(zhì)較多，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *，Taq酶活性不受影響，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高。
二、直接裂解法: 標(biāo)本(組織細(xì)胞，分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原體，裂解細(xì)胞。然后12000r/min離心5～10min，取上清20～30ul用于PCR擴(kuò)增。血清標(biāo)本可 直加等體積的消化液，加熱處理離心后PCR擴(kuò)增。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化處理，離心取上清，PCR擴(kuò)增檢測HBV DNA.
三、堿變性法: 取血清20ul，加入1mol/L NaOH 20ul，37℃30min，離心，加 1mol/L HCl 20ul，離心后，取上清5ul，用于PCR擴(kuò)增。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR，其特異性和敏感性較前法 更好。
四、煮沸法: 經(jīng)離心洗滌過的組織細(xì)胞，分泌物及血液標(biāo)本，加適量無菌蒸餾水或PBS，混勻 后，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min，取上清做PCR.
五、碘化鈉法: 取組織細(xì)胞及抗凝血液10～100ul，加等體積的6MNaI，反復(fù)輕混 20s，加等體積:(49:1)振勻后，離心取上清加0.6體積的異丙醇，混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI，0.5%十二烷基肌酸鈉，10ug糖原，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA)混勻后，60℃15min，加等體積異丙醇，離心沉定 后，加TE液用于PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)量和質(zhì)量較高。
六、異硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取。標(biāo)本為組織細(xì)胞及血清等。
1、異硫氰酸胍消化液
異硫氰酸胍4mol/L
檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸鈉0.5%
β-巰基乙醇0.1mol/L
2、消化方法: 用50～100ul細(xì)胞懸液及血清，加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后，或65℃1小時，或室溫放置數(shù)分鐘，然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液，再加等體積的酚:，用力振搖約10s，10000r/min，離心5min，取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后，14000r/min離心15min，沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1～ 2次，真空干燥，沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，或放-20℃保存。
其它消化處理標(biāo)本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法。③Chelex-100法。④全血直接擴(kuò)增法⑤尿素消化裂解法。各有千秋，可根據(jù)情況選用。
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