【檢測原理】
本試劑盒根據(jù)熒光 PCR 技術(shù)原理，針對 PCR試劑盒設(shè)計特異性引物和 Taqman 探針，通過熒光 PCR 檢測儀進行檢測，從而實現(xiàn)對 PCR試劑盒的檢 測。
【儲存條件及有效期】
1．避光-20℃儲存，有效期 12 個月。
2．低溫運輸不能超過 4 天；開封后避光-20℃儲存，對有效期沒有影響。避免反復(fù)凍融，凍融 6 次不影響檢測效果。
3．生產(chǎn)日期、有效期至：見外包裝盒。
【適用儀器】
適用于 ABI 7500、Bio-Rad CFX96、Roche480 等全自動熒光PCR 檢測儀。
【樣本要求】
1．樣本種類：鼻/咽拭子、痰液、支氣管肺泡灌洗液；培養(yǎng)物等樣品。
2．保存條件：采集的標(biāo)本應(yīng)及時送檢，24 小時內(nèi)檢測的應(yīng) 4℃保存，超過 24 小時的最好-70℃保存，并避免反復(fù)凍融。
【檢測方法】
1 ． 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
將試劑盒各組分置 4℃避光融化，充分混勻后瞬間離心。計算試劑使用份數(shù) N（N=樣本數(shù)+1 管陽性對照+1 管陰性對照），根據(jù)下表配置反應(yīng)體系mix，加入一適當(dāng)體積離心管中，充分混勻后瞬間離心，按 20μL 分裝至 PCR 反應(yīng)管/板，并轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
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組分 |
體積（μL ） |
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qPCR 預(yù)混液（含酶） |
16 |
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引物探針 |
4 |
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總體積（反應(yīng)體系 mix ） |
20 |
2 ． 樣本處理（樣本處理區(qū)）
① 核酸提取
選擇合適的核酸提取試劑盒提取核酸，具體按照相應(yīng)的試劑盒說明書操作。
② 加樣
在已加入反應(yīng)體系 mix 的 PCR 反應(yīng)管/板上分別加入處理好的待檢標(biāo)本核酸、陰性對照、陽性對照各 5μL，終體積為 25μL。
蓋緊管蓋或封膜，瞬間低速離心后置熒光 PCR 檢測儀擴增。
3 ． 擴增檢測（核酸擴增區(qū)）
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步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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①預(yù)變性 |
95℃ |
5min |
1cycle |
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②變性 退火/延伸/檢測熒光* |
95℃ 55℃ |
10s 40s |
40cycles |
*步驟②中 55℃時熒光檢測，檢測通道為 FAM。*ABI 系列熒光 PCR 儀不選 ROX 校正，淬滅基團選 None。
4 ． 結(jié)果分析根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)起止值，（建議起始設(shè)在 3～15、終止設(shè)在 5～20，同時調(diào)整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊分析，在報告界面查看結(jié)果。
【質(zhì)量控制】
1．陰性對照：Ct 值＞38 或未檢出。
2．陽性對照：擴增曲線呈 S 型，且 Ct 值≤30。
3．同一實驗以上要求需同時滿足，否則本次實驗視為無效。
4．每種檢測靶標(biāo)都需設(shè)陰陽對照，不同的靶標(biāo)根據(jù)對應(yīng)陰性調(diào)整基線閾值。
【結(jié)果判讀】
1．FAM 通道檢測 B 組鏈球菌。
2．陰性：Ct 值＞38 或未檢出。
3．陽性：擴增曲線呈 S 型，且 Ct 值≤35。
4．可疑：擴增曲線呈 S 型，且 35＜Ct 值≤38，需復(fù)檢；復(fù)檢結(jié)果若一致，判定結(jié)果為陽性。
【檢驗方法的局限性】
1．樣品采集、運輸、保存不當(dāng)，試劑運輸、保存、配置不當(dāng)都可能會影響實驗結(jié)果，甚至?xí)?dǎo)致假陰性結(jié)果。
2．如果實驗室污染、試劑污染、樣品交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
【注意事項】
1．PCR 操作各階段應(yīng)嚴格分區(qū)操作，避免交叉污染。
2．試劑盒各組分使用前應(yīng)充分融化混勻，離心數(shù)秒后使用。
3．各組分不得與其他產(chǎn)品或不同批號的相應(yīng)成分進行互換。
4．待測標(biāo)本若不及時檢測，應(yīng)保存于-20℃或-70℃。
5．樣品的處理應(yīng)該嚴格按照生物安全規(guī)范操作。
6．PCR 操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗和受過專業(yè)培訓(xùn)。
7．本試劑盒僅用于科研使用，不做為臨床診斷使用。
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資料/datasheet
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