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丁型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒
AP6214
貨號(hào) 純度 規(guī)格 目錄價(jià) 會(huì)員價(jià) 庫(kù)存 數(shù)量 購(gòu)買
AP6214-50T 50T ￥3490.00 登錄查看
產(chǎn)品詳情

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【預(yù)期用途】

本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門檢測(cè)的試劑盒。

【檢驗(yàn)原理】

          

本試劑盒即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，引物經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高，分析靈敏度可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)，提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品，特異性高，引物是根據(jù)指標(biāo)高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)，本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的染料法熒光定量 PCR 反應(yīng)，既可用于定性，也可用于定量。用于定量時(shí)線性范圍至少5個(gè)數(shù)量級(jí)。

【試劑組成】

名      稱

規(guī)      格

2×SYBR qPCR MasterMix

0.5mL×1管

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1mL×1 管

超純水

1mL×1 管

染料法qPCR 引物混合液

100μL×1 管

      qPCR 陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7 拷貝/μL)

50μL ×1 管

說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【運(yùn)輸及保存】

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

【自備試劑】

樣品 DNA。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測(cè)儀。

【使用方法】

  1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。

由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

3. 在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

  1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）

2.1如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 第 6 步所得的第 4 號(hào)稀釋液（1×10E4 拷貝/μL）再加上一定量的水使總體積跟核酸純化試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

2.2 核酸提?。汉怂崽崛】梢圆捎蒙虾嵘鷮?shí)業(yè)有限公司的核酸提取或純化試劑，操作方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。

3.染料法 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

3.1如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 6 步第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分

樣品管

N+2 個(gè)

PCR 陰性

對(duì)照管

標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品管（1-6 管）

2×SYBR qPCR

MasterMix

10μL

10μL

各10μL

染料法qPCR 引物混合液

2μL

2μL

各2μL

N+2 個(gè)待測(cè) DNA 模板

8μL

-

-

超純水

-

8μL

-

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6 號(hào)）

-

-

各 8μL（2 號(hào)樣到2 號(hào)管，3 號(hào)樣到

3 號(hào)管…）

蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

過(guò)程

 

溫度

 

時(shí)間

 

預(yù)變性

95℃

5 分

PCR反應(yīng)

（35個(gè)循環(huán)）

95℃

10 秒

60℃

40 秒（采集 SYBR 通道的熒光信號(hào)）

溶解曲線分析

 

按 qPCR 儀器手冊(cè)執(zhí)行

注意：循環(huán)次數(shù)不要超過(guò) 35 個(gè)循環(huán)。

【結(jié)果判定】

  1. 通過(guò)溶解曲線分析的結(jié)果排除無(wú)效數(shù)據(jù)。有 Ct 值，但 Tm 值跟陽(yáng)性對(duì)照 Tm不一樣的樣品（包括對(duì)照和待測(cè)樣品），歸為假陽(yáng)性，數(shù)據(jù)無(wú)效，不予以分析。Tm 跟陽(yáng)性對(duì)照 Tm 一致的，為有效 Ct。
  2. 如果兩種陰性對(duì)照的溶解曲線所得 Tm 值跟陽(yáng)性對(duì)照的 Tm 值一樣，說(shuō)明環(huán)境或試劑可能有過(guò)去的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染，則此次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需要解決污染問(wèn)題再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
  3. 如果兩種陰性對(duì)照（樣品制備陰性對(duì)照和 PCR 陰性對(duì)照）是假陽(yáng)性，可以繼續(xù)分析其它樣品有效數(shù)據(jù)。
  4. 對(duì)定量檢測(cè)，以陽(yáng)性對(duì)照樣品的濃度的 log 值為橫軸，以有效 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的有效 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再換算出待測(cè)樣品的 DNA 濃度。
  5. 對(duì)定性檢測(cè)，則有有效 Ct 值的為陽(yáng)性，無(wú)有效 Ct 值的為陰性。

【注意事項(xiàng)】

1．PCR 操作各階段應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作，避免交叉污染。

2．各組分不得與其他產(chǎn)品或不同批號(hào)的相應(yīng)成分進(jìn)行互換。

3．待測(cè)標(biāo)本若不及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)保存于-20℃或-70℃。

4．樣品的處理應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全規(guī)范操作。

5．PCR 操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗(yàn)和受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)。

6．本試劑盒僅用于科研使用，不做為臨床診斷使用。

 

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