【預(yù)期用途】
本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門指標(biāo)的試劑盒。
【檢驗原理】
本試劑盒即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板，引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高，提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品，特異性高，引物是根據(jù)指標(biāo)DNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)，既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級，本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
【試劑組成】
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名 稱 |
規(guī) 格 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5 mL×1管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1 mL×1 管 |
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超純水 |
1 mL×1 管 |
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探針法PCR引物-混合液 |
150ul×1 管 |
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探針法PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50 μL ×1 管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【運(yùn)輸及保存】
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個月。
【自備試劑】
樣品DNA。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【使用方法】
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
3. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
2.1如果有N個樣品，最好設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
2.2 核酸提?。汉怂崽崛】梢圆捎蒙虾嵘鷮崢I(yè)有限公司的核酸提取或純化試劑，操作方法按照說明書進(jìn)行。
3.Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
3.1如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
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成分 |
樣品管 N+2個 |
PCR陰性對照 |
標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管 （1-6管） |
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2×Probe qPCR MasterMix |
各10 μL |
10 μL |
各 10 μL |
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探針法PCR引物-混合液 |
各3 μL |
3 μL |
各 3 μL |
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N+2個待測DNA樣本 |
7 μL |
- |
- |
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超純水 |
- |
7 μL |
- |
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第6步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6號） |
- |
- |
各7μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
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過程
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溫度
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時間
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預(yù)變性 |
95℃ |
2min |
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PCR反應(yīng) （45個循環(huán)） |
95℃ |
15sec |
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58℃ |
30 sec（采集FAM通道的熒光信號，設(shè)置BHQ-1為淬滅基團(tuán)） |
【結(jié)果判定】
【注意事項】
1．PCR 操作各階段應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作，避免交叉污染。
2．試劑盒各組分使用前應(yīng)充分融化混勻，離心數(shù)秒后使用。
3．各組分不得與其他產(chǎn)品或不同批號的相應(yīng)成分進(jìn)行互換。
4．待測標(biāo)本若不及時檢測，應(yīng)保存于-20℃或-70℃。
5．樣品的處理應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全規(guī)范操作。
6．PCR 操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗和受過專業(yè)培訓(xùn)。
7．本試劑盒僅用于科研使用，不做為臨床診斷使用。
人皰疹病毒5型(human herpesvirus5，HHV-5) 原人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV)病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
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資料/datasheet
