丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義
PK（EC 2.7.1.40）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化糖酵解過程中的最后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一，因此測定PK活性具有重要意義。
測定原理
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PK活性。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制
提取液：100mL×1瓶，4℃保存;
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；；
試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；
試劑三：液體10μL×2支，4℃保存；
樣本的前處理
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟
（1）試劑二的配制：臨用前取試劑二一瓶，加入9mL試劑一和1.06mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用。
（2）試劑三的配制：臨用前取試劑三一支，加入0.6mL蒸餾水充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用。
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和 2min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。
PK活性計算
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清（漿）中PK活力的計算:
單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=1608×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、血清（漿）中PK活力的計算:
單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK（nmol/min /mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3216×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
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資料/datasheet
