葡萄糖-6-磷酸( Glucose 6-phosphate， 6P G)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100管/48樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
6PG (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸，又稱6-磷酸葡萄糖)，是糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，廣泛存在于動(dòng)植物體和微生物中。在糖酵解的第一步反應(yīng)中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通過(guò)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖-6-磷酸，以繼續(xù)糖酵解的其它步驟；而在戊糖磷酸途徑中，葡萄糖-6-磷酸是其第一個(gè)底物，該過(guò)程也是生成NADPH的主要途徑。此外，葡萄糖-6-磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被儲(chǔ)存起來(lái)。
測(cè)定原理：
6-磷酸葡萄糖脫氫酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH在1-mPMS的作用下使WST-8顯橙黃色，在450 nm下測(cè)定吸光值。
需自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體60 mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體12mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；
試劑三：液體1.5mL×1管， 4℃避光保存。
6PG提?。?/p>
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）， 8000g，25℃離心10min，取上清待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g，25℃離心10min，取上清待測(cè)。
3、血清（漿）等液體樣品：直接測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm。
2、試劑二的配制：臨用前加入3mL水充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存；
3、工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液
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試劑名稱（μL） |
測(cè)定工作液 |
對(duì)照工作液 |
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試劑一 |
100 |
100 |
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試劑二 |
50 |
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水 |
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50 |
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試劑三 |
10 |
10 |
按下表在96孔板中加入如下試劑
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試劑名稱（μL） |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
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樣本 |
50 |
50 |
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測(cè)定工作液 |
150 |
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對(duì)照工作液 |
|
150 |
37℃避光孵育30min，450nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)測(cè)定與A對(duì)照，△A=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
6PG含量計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 3.8589x - 0.0016，R2 = 0.997； x為6PG含量（μmol/mL），y為吸光值。
2、按照血清（漿）體積計(jì)算
6PG含量（nmol/mL）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷V1×1000
=259.1×(△A+0.0016)
3、按照蛋白濃度計(jì)算
6PG含量（nmol/mg prot）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(V1×Cpr)×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷Cpr
4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算
6PG含量（nmol/g鮮重）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷(W ×V1÷V2）×1000
=259.1×(△A+0.0016) ÷W
3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
6PG含量（nmol/104 cell）= [(△A+0.0016)÷3.8589×V1]÷（500×V1÷V2）×1000
=0.518×(△A+0.0016)
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)；1000，μmol到nmol的換算系數(shù)。
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