可見分光光度法 50 管/48 樣>
注
意：正式測(cè)定前務(wù)必取 3 - 5 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
β-甘露聚糖酶（
EC 3.2.1.78）廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。用于飼料工業(yè)，不僅可
以消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子甘露聚糖，提高飼料利用率，還能促進(jìn)有益菌的增殖，提高動(dòng)物
免疫功能。
β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖產(chǎn)生寡糖和單糖，還原性寡糖和單糖在沸水浴中與3,5-二硝
基水楊酸（DNS試劑）反應(yīng)顯色反應(yīng)，該顯色物質(zhì)在540nm下有最大吸收峰，通過測(cè)定還
原性糖的生成量進(jìn)而計(jì)算得出β-甘露聚糖酶的酶活性大小。
所需的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、
研缽、乙醇、冰和蒸餾水。
試劑盒組分與配制：
提取液：液體 60mL ×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 15mL ×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑 ×2 瓶，4℃保存；臨用前甩幾下使粉體落入底部，每瓶加 5mL 試劑一，
可超聲至溶解，溶解后 4℃保存。
試劑三：液體 10mL ×2 瓶，4℃保存；
β-甘露聚糖酶活性測(cè)定：
一、樣本制備：
1、 組織：
1. 稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇冰浴勻漿，
4℃放置 10min；離心 5min（12,000rpm 4℃）；棄上清，留沉淀，
2. 向沉淀中加入經(jīng)預(yù)冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；離心 5min（12,000rpm 4℃）；
棄上清，留沉淀。
3. 再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；離心 10min
（12,000rpm 4℃）；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測(cè)。
2、 細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞：
1. 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；
2. 取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％
或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；
3. 離心 10min（12,000rpm 4℃），取上清，置冰上待測(cè)。
【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10
4 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500：1
的比例進(jìn)行提取。
3、 液體樣本：
a) 若是澄清液體，直接檢測(cè)；
b) 若液體樣本渾濁，需離心 10min（12,000rpm 4℃），取上清液檢測(cè)。
2、上機(jī)檢測(cè)：
1、 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 所有試劑解凍至室溫（25℃），
3、 在 EP 管中依次加入：
【注】若ΔA 差值低于 0.01，可增加樣本取樣質(zhì)量 W 或延長(zhǎng)孵育時(shí)間 T(如增至 60min)或
增加樣本加樣體積 V1（如增至 120μL，則試劑二相應(yīng)減少），則改變后的 W 和 T 和 V1
需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 結(jié)果計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 8.2857x - 0.0325；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（mg），y 為ΔA。
2、按照蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1μmol 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
β-甘露聚糖酶活力(μmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0325)÷8.2857÷Mr×10
3
]÷(Cpr×V1)÷T =16.8×(ΔA+0.0325) ÷Cpr
3、按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每克組織每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1μmol 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
β-甘露聚糖酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0325)÷8.2857÷Mr×10
3
]÷(W×V1÷V)÷T =16.8×(ΔA+0.0325)÷W
4、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1nmol 還原糖定為一個(gè)酶活力單位。
β-甘露聚糖酶活力(nmol/h/10
4cell)=[(ΔA+0.0325)÷8.2857÷Mr×10
6
]÷(500×V1÷V)÷T =16.8×(ΔA+0.0325)
5、按液體體積計(jì)算：
單位定義：每毫升液體每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1nmol 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
β-甘露聚糖酶活力(μmol/h/mL)=[(ΔA+0.0325)÷8.2857÷Mr×10
6
]÷V1÷T =16.8×(ΔA+0.0325)
V---加入提取液體積，1 mL；
V1---加入樣本體積，0.08mL；
T---反應(yīng)時(shí)間，30 min=0.5 小時(shí)；
W---樣本質(zhì)量，g；
500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，萬；
Mr---180.55，標(biāo)準(zhǔn)品為甘露糖；
Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒；
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預(yù)實(shí)驗(yàn)的意義： 比色法檢測(cè)試劑盒預(yù)實(shí)驗(yàn)非常重要 1、確定該試劑盒是否適合客戶的樣本檢測(cè)，以免造成試劑盒和樣本的浪費(fèi)（比如低表達(dá) 處理的樣本）； 2、熟悉生化試劑盒的操作流程，尤其是初次使用生化試劑盒測(cè)定； 3、確定樣本的處理方法及稀釋倍數(shù)是否合適； 4、了解實(shí)驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象或問題，以便于及時(shí)作出調(diào)整； 5、通過 3 - 5 組預(yù)實(shí)驗(yàn)，判斷試劑盒對(duì)于樣本的最佳適應(yīng)稀釋濃度范圍，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)樣本 稀釋比例。 |
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