NADPH 氧 化 酶 （ NADPH oxidase） 活 性
微板法 100 管/48 樣>
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取 3 - 5 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
NADPH 氧化酶（NAO）是一個(gè)典型的膜蛋白 ，催化 NADPH 氧化生成 NADP+ ， 并將電子傳遞給氧原子從而產(chǎn)生超氧陰離子。廣泛存在于動(dòng)物、植物和真菌中。該酶異?？?nbsp;導(dǎo)致人慢性肉芽腫病（GCD） ，在植物中 ，該酶與其抗病性和各種脅迫有密切關(guān)系。
NADPH 氧化酶（NAO）將 NADPH 氧化為 NADP+的同時(shí)生成超氧陰離子(O2 .- )， 接著與顯色劑反應(yīng)生成水溶性的黃色物質(zhì)。對(duì)照通過添加該酶的特異性抑制劑 DPI 排除背 景值。最終檢測(cè)生成的有色物質(zhì)在 450nm 處的吸光值，即可計(jì)算得出 NAO 酶活性大小。
試劑盒組分與配制：
所需的儀器和用品：
酶標(biāo)儀、 96 孔板、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。
① 若凝固可放置室溫或 25℃水浴溶解。
NADPH 氧化酶（NAO）活性測(cè)定：
一、樣本制備：
1、 組織樣本 ：取約 0.1g 組織 ，加入 1mL 提取液 ，在 4oC 或冰浴進(jìn)行勻漿(或使用各 類常見勻漿器)。離心 10min（ 12,000rpm 4℃) , 取上清作為待測(cè)液。
【注】 ：若增加樣本量 ，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例進(jìn)行 提取
2、 細(xì)菌/細(xì)胞樣本 ：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi) ，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或 細(xì)胞加入 1mL 提取液 ，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴 ，功率 200W ，超聲 3s ，間隔 10s ，重復(fù) 30 次） ；離心 10min（ 12,000rpm 4℃) , 取上清 ，置冰上待測(cè)。
【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104 ）：提取液（mL）為 500~1000：1 的 比例進(jìn)行提取。
3、 液體樣本 ：直接檢測(cè)；若渾濁 ，離心后取上清檢測(cè)。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上 ，設(shè)定溫度 37℃ , 調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。
2、 試劑三的配制：用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，分別加 0.55mL 蒸餾水溶解備用。 （用不完的試劑分裝后-20℃保存 ，禁止反復(fù)凍融 ，三天內(nèi)用完）
3、 所有試劑解凍至室溫（25℃) 。
三、操作測(cè)定：
1、NADPH 氧 化 酶 （ NADPH oxidase） 活 性 在 96 孔板中依次加入：
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試劑名稱(μL） |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
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樣本 |
20 |
20 |
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提取液 |
150 |
145 |
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試劑一 |
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5 |
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37℃孵育 5min（可能會(huì)產(chǎn)生沉淀 ，但不影響后續(xù)測(cè)定） |
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試劑二 |
10 |
10 |
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試劑三 |
10 |
10 |
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試劑四 |
10 |
10 |
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37℃ 避光孵育 20min ，于 450nm 讀取吸光值 A， ΔA =A 測(cè)定-A 對(duì)照。 |
||
【注】：若△A 的值在零附近 ，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如至 40min 或更長(zhǎng)） ，則改變后的 反應(yīng)時(shí)間 T 需代入公式重新計(jì)算。
結(jié)果計(jì)算：
2、 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘在反應(yīng)體系中使 450nm 處吸光值變化0.01 為一酶活單 位。
NAO(△OD450/min/mg prot) =ΔA÷(V1×Cpr) ÷0.01÷T
=250 ×ΔA÷Cpr
3、 按樣本鮮重計(jì)算：
酶活定義 ：每克組織每分鐘在反應(yīng)體系中使 450nm 處吸光值變化 0.01 為一酶活單位。
NAO(△OD450/min/g 鮮重) =ΔA÷(W ×V1÷V) ÷0.01÷T
=250 ×ΔA÷W
4、 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
酶活定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘在反應(yīng)體系中使 450nm 處吸光值變化 0.01 為一 酶活單位。
NAO(△OD450/min /104 cell) =ΔA÷(500 ×V1÷V) ÷0.01÷T
=0.5 ×ΔA
V---加入提取液體積 ， 1mL；
V1---加入樣本體積 ，0.02mL；
T---反應(yīng)時(shí)間 ， 20min；
建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。
W---樣本質(zhì)量 ，g；
500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù) ，萬(wàn)；
Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度 ， mg/mL；
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預(yù)實(shí)驗(yàn)的意義： 比色法檢測(cè)試劑盒預(yù)實(shí)驗(yàn)非常重要 1、確定該試劑盒是否適合客戶的樣本檢測(cè) ，以免造成試劑盒和樣本的浪費(fèi)（比如低表達(dá) 處理的樣本）； 2、熟悉生化試劑盒的操作流程 ，尤其是初次使用生化試劑盒測(cè)定； 3、確定樣本的處理方法及稀釋倍數(shù)是否合適； 4、了解實(shí)驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象或問題 ，以便于及時(shí)作出調(diào)整； 5、通過 3 - 5 組預(yù)實(shí)驗(yàn) ，判斷試劑盒對(duì)于樣本的最佳適應(yīng)稀釋濃度范圍 ，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)樣本 稀釋比例。 |
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