NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH， NADP-MDH主要存在于真核細胞中。
測定原理：
NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一、提取液100 mL×1瓶，在4℃保存；
試劑二、液體20 mL×1瓶，在4℃保存；
試劑三、粉劑×1瓶，-20℃保存；
樣本測定的準備：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
2、檢測工作液的配制：用時在試劑三中加入19mL試劑二和0.5mL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
3、測定前將檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液，混勻后立即記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和 1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。
注意：若A1-A2大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A1-A2小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
NADP-MDH活力單位的計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清（漿）NADP-MDH活力的計算
單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA
2、組織、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=12.86×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、血清（漿）NADP-MDH活力的計算
單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=12860×ΔA
2、組織、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =12860×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=25.72×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。
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資料/datasheet
