產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系工作人員。
溶液的配制：
1、 試劑一：臨用前每瓶加入 16 mL 提取液充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用。溶解后易氧化，24h 要盡快用完。
產(chǎn)品說明：
酪氨酸酶（tyrosinase：EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶，是具有雙功能的含銅糖蛋白，廣泛存在于植物、
酵母和動物組織中。酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，也是引起果蔬酶促褐變的主要因素，同時也對昆蟲
的免疫及生長有重要影響
酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素，其在475nm下有特征吸收峰，進而測定出酪氨酸酶的活性。
注意：實驗之前建議選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者
增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、細(xì)胞超聲破碎儀、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研
缽/勻漿器、冰、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 20min，取上清，置冰上待測。
2、細(xì)胞或細(xì)菌樣本的制備：先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每 500 萬細(xì)胞或細(xì)菌加入 1mL
提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 200w，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）。12000g，4℃離心 20min，取上清，
置冰上待測。
3、血清（漿）：直接檢測。若有渾濁則離心后取上清使用。
二、測定步驟
1、 分光光度計預(yù)熱30min，波長調(diào)至475nm。蒸餾水調(diào)零。
2、 加樣表（在1mL玻璃比色皿中分別加入）
將上述試劑分別加入比色皿后迅速吹打混勻，記錄第 10s 的吸光值 A1，迅速置于 37℃（哺乳動物）或 25℃
（其他物種）水浴或培養(yǎng)箱中 3min，拿出迅速擦干測定 3min10s 時的吸光值 A2，計算 ΔA =A2 -A1。
三、酪氨酸酶酶活計算
1、按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個酶活性單位。
酪氨酸酶（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣×Cpr)÷T=90.09×ΔA÷Cpr
2、按樣本質(zhì)量計算：
單位的定義：每g組織每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個酶活性單位。
酪氨酸酶（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(W÷V提取×V樣)÷T=90.09×ΔA÷W
3、按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計算：
單位的定義：每104個細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個酶活性單位。
酪氨酸酶（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(500÷V提取×V樣)÷T=0.18×ΔA
4、按血清（漿）體積計算：
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個酶活性單位。
酪氨酸酶（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷V樣÷T=90.09×ΔA
V反總：反應(yīng)總體積，10-3L；ε：多巴色素的摩爾消光系數(shù)：3.7×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；109：
單位換算系數(shù)，1mol=109nmol；V樣：加入的樣本體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；
V提?。禾崛∫后w積，1mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，3min。
注意事項：
1. 當(dāng)ΔA大于0.3時，建議將樣本用提取液稀釋后測量；ΔA過小時，建議增加酶促反應(yīng)時間（5min或10min）或增
加加入的樣本體積來測定。計算時注意同步修改計算公式。
實驗實例：
1、 取 0.1g 稗 草 葉 加 入 1mL 提 取 液 進 行 勻 漿 研 磨 ， 取 上 清 后 按 照 測 定 步 驟 操 作 ， 測 得 計 算
ΔA=A2-A1=0.105-0.054=0.051，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
酪氨酸酶（U/g 質(zhì)量）=90.09×ΔA÷W=90.09×0.051÷0.1=45.95U/g 質(zhì)量。
2、 取 0.1g 土豆加入 1mL 提取液進行勻漿研磨，取上清稀釋 4 倍后按照測定步驟操作，測得計算
ΔA=A2-A1=0.200-0.047=0.153，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
酪氨酸酶（U/g 質(zhì)量）=90.09×ΔA÷W×F（稀釋倍數(shù)）=90.09×0.153÷0.1×4=551.35U/g 質(zhì)量。
3、 取兔血清后按照測定步驟操作，測得計算 ΔA=A2-A1=0.388-0.328=0.06，按樣本體積計算酶活得：
酪氨酸酶（U/mL）=90.09×ΔA=90.09×0.06=5.4 U/mL。
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資料/datasheet
