乙醇脫氫酶（ADH）活性測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動(dòng)物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。
測定原理：
ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD+沒有；測定340nm 吸光度下降速率，來計(jì)算ADH活性。
自備儀器和用品：
研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1瓶，室溫保存。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×2瓶，－20℃保存，臨用前每瓶加入9mL試劑二，現(xiàn)配現(xiàn)用。
試劑四：液體×1支，4℃保存。
粗酶液提?。?/p>
3、血清等液體：直接測定。
ADH測定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min。
3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL樣本上清液、160μL試劑三和20μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時(shí)吸光值，分別記為A1和A2。△A測定管=A1-A2。
計(jì)算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T
=1608×△A ÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T
=1608×△A
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T
=3215×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=3215×△A÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=3215×△A÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。
ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T
=3215×△A
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
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資料/datasheet
