半胱氨酸（cysteine, Cys）含量測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
蛋白質(zhì)含有三種含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中，Cys是唯一一種含有巰基的含硫氨基酸，從甲硫氨酸轉(zhuǎn)化而來，并且可與胱氨酸互相轉(zhuǎn)化。Cys參與蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，經(jīng)常是蛋白質(zhì)活性中心的組成部分，還可以為其它生理生化反應(yīng)提供巰基。此外，Cys大量積聚在皮膚和粘膜表面，在角蛋白生成中維持重要的巰基酶的活性，并且補充巰基，以維持皮膚的正常代謝，調(diào)節(jié)表皮最下層的色素細胞生成的底層黑色素。具有美白、解毒、改善炎癥和過敏性皮膚等作用。
測定原理：
Cys還原磷鎢酸生成鎢藍，在600nm處有吸收峰；通過600nm吸光度，計算Cys含量。
自備儀器和用品：
低溫離心機、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、85％磷酸和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。用前1天，向試劑三中加2.5mL蒸餾水充分溶解，再加85％磷酸0.625mL，混勻后蓋緊（防止水分散失）沸水浴2h；冷卻后加10mL蒸餾水，4℃可保存2周。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶，臨用前加10 mL蒸餾水，充分溶解。1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，4℃避光保存。用不完的試劑4℃可保存3天。
半胱氨酸提取：
4℃離心10min，取上清液，待測。
測定操作：
1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到600 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL蒸餾水，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測定吸光值，記為A空白管。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測定吸光值，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 測定管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL上清液，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測定吸光值，記為A測定管。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要做一次。
計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1. 按液體樣品的體積計算：
半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)
2. 按樣本質(zhì)量計算：
半胱氨酸含量（μmol/g 鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）÷W=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W
3. 按照蛋白濃度計算：
半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷（V樣×Cpr）=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr
4. 按細胞數(shù)量計算：
氨基酸含量（μmol /104 cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細胞數(shù)量）=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細胞數(shù)量
C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.02 mL；V樣總：樣品提取液，1mL；W：樣品質(zhì)量，g。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
1. 按液體樣品的體積計算：
半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)
2. 按質(zhì)量計算：
半胱氨酸含量（μmol/g 鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）÷W=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W
3. 按照蛋白濃度計算：
半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷（V樣×Cpr）=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr
4. 按細胞數(shù)量計算：
氨基酸含量（μmol /104 cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細胞數(shù)量）=1×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細胞數(shù)量
C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.02 mL；V樣總：樣品提取液，1mL；W：樣品質(zhì)量，g。
注意事項：
最低檢出限為100μmol/L。
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資料/datasheet
