羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
HYP是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
測(cè)定原理：
樣品經(jīng)水解產(chǎn)生游離的HYP，進(jìn)一步被氯胺T氧化，氧化產(chǎn)物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，產(chǎn)生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過測(cè)定樣品水解液560nm吸光值，可計(jì)算HYP含量。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、烘箱、玻璃管、離心機(jī)、水浴鍋、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、無水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。
試劑組成和配制：
組織提取液：6mol/L鹽酸，自備。濃鹽酸：H2O（V/V）= 1:1，室溫保存。
細(xì)胞提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
羥脯氨酸提?。?/p>
測(cè)定操作表：
|
|
對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
|
樣本（μL） |
|
60 |
|
試劑一（μL） |
60 |
60 |
|
混勻，室溫靜置20min |
||
|
試劑二（μL） |
60 |
60 |
|
H2O（μL） |
180 |
120 |
|
混勻，60℃，20min，取出后25℃靜置15 min，取200μL于微量石英比色皿/96孔板中檢測(cè)560nm處吸光值。ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照 |
||
羥脯氨酸含量計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按樣品重量計(jì)算
組織羥脯氨酸含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.154×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
細(xì)胞羥脯氨酸含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）
（3）按血清體積計(jì)算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反總÷V樣×2
=0.154×（ΔA-0.0251）
V反總：反應(yīng)總體積，0.3 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積， mL；W：樣本重量，g
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=32.4375x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按樣品重量計(jì)算
HYP含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.308×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）
（3）按血清體積計(jì)算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×2
= 0.308×（ΔA-0.0251）
V反總：反應(yīng)總體積，0.3 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積， mL；W：樣本重量，g；2，血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。
注意事項(xiàng)：
掃描二維碼
掃描二維碼
資料/datasheet
可可.jpg)
