中性轉(zhuǎn)化酶（Neutral invertase, NI）試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一。根據(jù)最適 pH，將高等植物Ivr分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）兩種類型。
NI主要存在于細胞質(zhì)中，負責分解細胞質(zhì)中蔗糖為果糖和葡萄糖。
測定原理：
NI催化蔗糖分解產(chǎn)生還原糖，進一步與3,5－二硝基水楊酸反應(yīng)，生成棕紅色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定范圍內(nèi)510nm光吸收值與還原糖生成量成正比。通過光吸收增加速率來計算NI活性
自備用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存;
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存;
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入10mL試劑一充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；
試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟和加樣表：
2、樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：
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試劑名稱（μL） |
測定管 |
對照管 |
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樣本 |
50 |
50 |
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試劑一 |
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200 |
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試劑二 |
200 |
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混勻， 37℃準確水浴30min后，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）
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試劑三 |
125 |
125 |
混勻，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中， 510nm處記錄各管吸光值A(chǔ)，如果吸光值大于2，可以用蒸餾水稀釋后測定（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。
NI活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。
（1）按蛋白濃度計算：
單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。
NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr
（2）按鮮重計算：
單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。
NI活性（μg/min /g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。
（1）按蛋白濃度計算：
單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。
NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr
（2）按鮮重計算：
單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。
NI活性（μg/min /g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
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資料/datasheet
