NAD-蘋果酸酶（Malic enzyme ，NAD-ME）試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物ME活性測定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測定原理：
NAD-ME催化NAD+還原成NADH，在340nm下測定NADH增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存。；
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；
樣本的前處理：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、55μL試劑二和160μL工作液，混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和 1min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意：如果ΔA＜0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長到2分鐘或5分鐘。
NAD-ME活性計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T = 3617×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =7.234×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T = 7234×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T =14.468×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
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資料/datasheet
