谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。
測定原理：
GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時NADPH脫氫生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在該波長無吸收峰；通過測定340 nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計算GR活性。
自備儀器和用品：
低溫離心機、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水
試劑組成和配置：
試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入1.2mL蒸餾水，混勻。
試劑三：粉劑×2支，-20℃保存。臨用前加入0.6mL蒸餾水，混勻。
粗酶液提取：
操作步驟：
1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一置于25℃（普通物質(zhì)）或者37℃（哺乳動物）中預(yù)熱30min。
3. 測定管：取微量石英比色皿或96孔板，依次加入10μL試劑三，20μL試劑二，150μL試劑一，20μL上清液，混勻，于340nm迅速測定初始吸光度和180 s吸光度，記為A測1和A測2，△A測定管= A測1﹣A測2。
(注意：
3.當所測△A測定管的值在零點附近徘徊時，可能原因：（1）樣本GR酶活性低，建議濃縮樣本后再進行測定；（2）樣本GR酶活性過高，吸光值變化區(qū)間過小無法準確測出，建議樣本稀釋2~5倍后再進行測定)
計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T
= 536×△A測定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 536×△A測定管÷W
(3) 按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個細胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
= 536×△A測定管÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mL)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T
= 536×△A測定管
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL =2×10-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，3 min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T
= 1072×△A測定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 1072×△A測定管÷W
(3) 按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每104個細胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A測定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1072×△A測定管÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。
GR酶活(nmol/min/mL)= [ (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T
=1072×△A測定管
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL =2×10-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，3 min。
注意事項：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；
（2）試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的4℃保存，三天內(nèi)使用完。
（3）測定前須先用1～2個樣做預(yù)實驗，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋2～5倍。
（4）細胞中GR活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GR的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。
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資料/datasheet
