土壤硝酸還原酶（Solid-Nitrate Reductase，S-NR）試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100管/48樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
S-NR催化土壤中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，是土壤硝態(tài)氮還原的關(guān)鍵酶。研究S-NR的活性對(duì)合理施肥，降低氮素的損失具有重要意義。
測(cè)定原理
S-NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對(duì)–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物；生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。
需自備的儀器和用品
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：液體12mL×1瓶，-20℃保存。
試劑二：液體8mL×1瓶，-20℃保存。
試劑三：液體9mL×1瓶，4℃保存（如出現(xiàn)結(jié)晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）。
試劑四：液體9mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1mL，-20℃保存。
0.1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液的配制：用時(shí)將試劑五稀釋100倍，即取 0.1ml 加蒸餾水定容至 10ml。
樣品處理：
新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干，過(guò)30~50目篩。
測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
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試劑名稱(chēng) |
1mL帶蓋離心管 |
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測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
空白管 |
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風(fēng)干土樣（g） |
0.06 |
0.06 |
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0.1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液（μL） |
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60 |
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蒸餾水（μL） |
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225 |
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285 |
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試劑一（μL） |
225 |
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225 |
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試劑二（μL） |
75 |
75 |
75 |
75 |
混勻后，蓋蓋后37℃水浴24h，8000g 25℃離心10min，取上清液
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上清液（μL） |
130 |
130 |
130 |
130 |
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試劑三（μL） |
85 |
85 |
85 |
85 |
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試劑四（μL） |
85 |
85 |
85 |
85 |
混勻，25℃顯色20min，4000g，25℃離心10min，取200uL上清液至微量石英比色皿或96孔板中，540nm下讀取各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測(cè)一次。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
注意點(diǎn)：
務(wù)必先做2個(gè)樣本的預(yù)測(cè)定，少部分土壤由于樣本特殊性可能出現(xiàn)測(cè)定管小于對(duì)照管，請(qǐng)及時(shí)與我司技術(shù)支持聯(lián)系，以獲得針對(duì)樣本特殊性的調(diào)整測(cè)定方法。
S-NR活性計(jì)算：
單位的定義：每天每g土樣中產(chǎn)生1μmol NO2ˉ的量為一個(gè) S-NR活力單位。
S-NR（μmol /d/g土樣）=C標(biāo)準(zhǔn)×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V反總÷W÷T =0.5×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）
C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1μmol/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；T：反應(yīng)時(shí)間，24h； W：樣本質(zhì)量，0.06g。
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