多聚半乳糖醛酸酶（ploygalacturonase，PG）試劑盒說明書
微量法100T/48S
注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義
多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一種細胞壁結(jié)合蛋白，可以催化果膠分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解，參與果膠的降解，使細胞壁結(jié)構(gòu)解體，導致果實軟化，與果實成熟、葉和花的脫落、病原物防御，細胞伸展發(fā)育以及木質(zhì)化有關，在植物抗病性和食品貯藏保鮮領域具有較高的研究價值。
測定原理
多聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與DNS試劑反應生成紅棕色物質(zhì)，在540nm有特征吸收峰，測定540nm處吸光值變化可計算得多聚半乳糖醛酸酶活性。
自備實驗用品及儀器
天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體8mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。
酶液提取
1．組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。16000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2．細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后16000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
3．培養(yǎng)液：直接檢測。
測定操作表
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對照管 |
測定管 |
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樣本（μL） |
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30 |
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煮沸樣本（μL） |
30 |
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試劑一（μL） |
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120 |
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蒸餾水 |
120 |
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40℃水浴30min |
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試劑二（μL） |
150 |
150 |
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沸水浴5min，冰浴或自來水冷卻，取200μL于微量石英比色皿/96孔板測定540nm處吸光值A，△A=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。 |
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酶活性計算公式
標準曲線：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996；x為標準品濃度，mg/mL；y為吸光值。
1．按照蛋白濃度計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每克樣本每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷W
3．按液體體積計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)
4. 按細胞數(shù)量計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每104個細胞每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數(shù)量
V反總：反應總體積，0.15mL；V樣：反應中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，0.5h
標準曲線：y = 1.9821x - 0.008，R2 = 0.9996；x為標準品濃度，mg/mL；y為吸光值。
1．按照蛋白濃度計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每克樣本每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位（U）。
PG活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷W
3．按液體體積計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位（U）。
PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)
4. 按細胞數(shù)量計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每104個細胞每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位（U）。
PG活性（mg/h/104cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷細胞數(shù)量
V反總：反應總體積，0.15mL；V樣：反應中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，0.5h
注意事項
煮沸樣本建議將樣本在沸水中煮沸10分鐘，以將酶徹底滅活。
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資料/datasheet
