過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒(鉬酸銨比色法)說明書
微量法100管/96樣
測(cè)定意義：
CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。
測(cè)定原理：
過氧化氫能氧化MoO42-成MoO52-,MoO52-接受氫氧根的電子成鍵，分子間立即脫水縮合，得到穩(wěn)定的黃色復(fù)合物(H2MoO4·XH2O)n在405nm處有強(qiáng)烈吸收峰，其吸光值和過氧化氫濃度成線性關(guān)系。測(cè)定出體系剩余過氧化氫在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。
需自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制：
提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃避光保存；
試劑二：液體25 mL×1瓶，常溫保存；
試劑三：液體60 mL×1瓶，4℃保存；
粗酶液提?。?/p>
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
2、在EP管中加入下列試劑
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試劑名稱（μL） |
測(cè)定管 |
空白管 |
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樣本 |
10 |
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試劑一 |
60 |
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混勻，25℃準(zhǔn)確反應(yīng)2 min |
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試劑二 |
200 |
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試劑三 |
530 |
530 |
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試劑二 |
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200 |
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提取液 |
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10 |
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試劑一 |
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60 |
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混勻，取200μL于96孔板立即測(cè)定A空白和A測(cè)定，ΔA=A空白-A測(cè)定?？瞻坠苤恍枳鲆还?。 |
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CAT活性計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.09x + 0.0013 R2 = 1 x：體系中過氧化氫濃度變化值（μmol/mL）
y：吸光值差值ΔA
2、血清（漿）CAT活力的計(jì)算:
單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷V樣÷T
=444.44×(ΔA-0.0013)
3、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T
=444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷（W× V樣÷V樣總）÷T
=444.44×(ΔA-0.0013)÷W
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.8 mL；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。
注意事項(xiàng)：
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