花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
花青素還原酶是黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物體內(nèi)起非常重要的調(diào)控作用，對(duì)花青素還原酶的調(diào)控機(jī)制研究有利于從基因水平改變植物的品質(zhì)。
測(cè)定原理
花青素還原酶在NADPH存在的條件下作用于飛燕草色素轉(zhuǎn)變?yōu)楸頉]食子兒茶素和NADP，使反應(yīng)體系在340nm處的吸光值下降，吸光值下降速率反應(yīng)了花青素還原酶的活性。
需自備的儀器和用品
天平、研缽、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
酶液提取
測(cè)定操作表
|
試劑名稱 |
測(cè)定管 |
|
試劑一（μL） |
150 |
|
試劑二（μL） |
10 |
|
酶液（μL） |
20 |
|
試劑三（μL） |
10 |
|
試劑四（μL） |
10 |
充分混勻，于微量石英比色皿/96孔板測(cè)定340處吸光值A(chǔ)1，然后在40℃溫育20min后，再測(cè)定340nm處吸光值A(chǔ)2，△A=A1-A2
酶活性計(jì)算公式
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
ANR活性（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T
= 80.39×ΔA÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每克組織每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
ANR活性（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T
= 80.39×ΔA÷W
酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
ANR活性（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T
= 80.39×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
ANR活性（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T
= 160.78×ΔA÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每克組織每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
ANR活性（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T
= 160.78×ΔA÷W
（3）按液體體積計(jì)算
酶活性定義：在40℃，pH6.5條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
ANR活性（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T
= 160.78×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
掃描二維碼
掃描二維碼
資料/datasheet
可可.jpg)
