單寧酶（Tannase，TAN）試劑盒說明書
微量法100管/48樣
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義
單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖。
測定原理
使用抗氧化劑沒食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應的底物，在270nn下測定底物PG反應前后的光密度變化,計算單寧酶酶活力。
需自備的的儀器和用品
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽、冰、蒸餾水
試劑的組成和配制
試劑一：液體100mL×2瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前每支加入6mL試劑一，充分溶解后備用；用不完的試劑4℃保存；
粗酶液提取
按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
液體樣本：直接取上清測定。
測定步驟
1、分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長到270 nm，蒸餾水調零。
2、加樣表
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試劑名稱（μL） |
對照管 |
測定管 |
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95℃水浴5min后滅活的粗酶液 |
50 |
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粗酶液 |
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50 |
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試劑二 |
50 |
50 |
混勻，40℃準確保溫10 min后，置95℃水浴中10 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻
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試劑一 |
900 |
900 |
混勻，取200uL至微量石英比色皿或96孔UV板中，270nm處讀取各管吸光值。計算ΔA=A對照-A測定。每個測定管需設個一個對照管。
注意：
TAN活力單位的計算
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準條件下測定回歸方程為y = 0.0058x + 0.0044，R2 = 0.9994；x為PG含量（μmol/L），y為吸光值。
單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位。
TAN活性(μmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T
=34.48×( ΔA-0.0044）
2、按照蛋白濃度計算
單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性((μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T
=34.48×(ΔA-0.0044）÷Cpr
3、按照樣本鮮重計算
單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=34.48×(ΔA-0.0044）÷W
V反總：反應體系總體積，1mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準條件下測定回歸方程為y = 0.0029x + 0.0044，R2 = 0.9994；x為PG含量（μmol/L），y為吸光值。
1、按樣本體積計算
單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性(μmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T
=68.97×( ΔA-0.0044）
2、按照蛋白濃度計算
單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少1μmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V樣×Cpr)÷T
=68.97×( ΔA-0.0044）÷Cpr
3、按照樣本鮮重計算
單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01μmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。
TAN活性(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=68.97×( ΔA-0.0044）÷W
V反總：反應體系總體積，1mL； V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。
掃描二維碼
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資料/datasheet
