脯氨酸（PRO）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
Pro廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，逆境條件下，植物體內(nèi)Pro含量顯著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標(biāo)之一。
測(cè)定原理：
用磺基水楊酸（SA）提取Pro，加熱處理后，Pro與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色；加甲苯萃取后，在520nm測(cè)定吸光度。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、冰乙酸25mL、甲苯50mL、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：冰乙酸25 mL×1瓶， 4℃保存。（自備）
試劑二：液體25 mL×1瓶， 4℃保存。
試劑三：甲苯50mL×1瓶，4℃保存。（自備）
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；之后置95℃水浴振蕩提取10min；10000g，25℃離心10min，取上清，冷卻后待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），勻漿；之后置95℃水浴振蕩提取10min；10000g，25℃離心10min，取上清，冷卻后待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），充分混勻，之后置95℃水浴振蕩提取10分鐘，10000g，25℃離心10分鐘，取上清，冷卻后待測(cè)。
測(cè)定步驟：
(1) 取0.25mL樣本+0.25mL試劑一+0.25mL試劑二 于有蓋EP管中，置95℃水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），每10min振蕩一次。
(2) 待冷卻后，加入0.5mL試劑三，振蕩30s，靜置片刻，使色素轉(zhuǎn)至試劑三中；吸取0.2mL上層溶液于微量石英比色皿或96孔板中，于520nm波長(zhǎng)處比色，記錄吸光值A(chǔ)。
Pro含量計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、典型回歸方程y = 0.0521x - 0.0021 (x為脯氨酸含量，μg/mL；y為吸光值A(chǔ))
2、按照血清（漿）體積計(jì)算
Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)
3、按照蛋白濃度計(jì)算
Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr
4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算
Pro含量(μg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W
5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、典型回歸方程y = 0.02605x - 0.0021 (x為脯氨酸含量，μg/mL；y為吸光值A(chǔ))
2、按照血清（漿）體積計(jì)算
Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)
3、按照蛋白濃度計(jì)算
Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr
4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算
Pro含量(μg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W
3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
注意：最低檢測(cè)限為1μg/mL或1μg /g鮮重 或0.01μg /mg prot
掃描二維碼
掃描二維碼 撫生公眾號(hào) |
 客服-夏菊花 |
 客服-陳筱筱 |
 客服-李瑞瑞 |
可可.jpg) 客服-郭笑笑 |
 客服-李爽 |
客服-林燕 |
資料/datasheet