蛋白質(zhì)羰基含量測定試劑盒
微量法100T/48S
注意：正式實驗之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
蛋白質(zhì)羰基是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志，其含量高低表明蛋白質(zhì)氧化損傷程度的大小，是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的主要指標(biāo)。
測定原理：
羰基與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成紅色2,4-二硝基苯腙，在370nm處有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器：
天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、漩渦震蕩儀、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑0.1g×5支，4℃避光保存。（使用前根據(jù)樣品數(shù)，每支加1mL水溶解，每支為10個樣品用量）
試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體15mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：根據(jù)測定樣品量，將乙酸乙酯和無水乙醇等體積混合。
試劑六：液體60mL×1瓶，4℃保存。
樣品處理：
組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，4000g離心10min，取上清，加入0.1mL試劑一，室溫放置10min，4℃，10000g離心10min，取上清待測。
細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
血清等液體樣本：直接測定。
測定步驟和操作表：
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對照管 |
測定管 |
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樣品（μL） |
60 |
60 |
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試劑二（μL） |
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120 |
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試劑三（μL） |
120 |
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混勻，37℃避光反應(yīng)1h |
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試劑四（μL） |
150 |
150 |
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靜置5min，4℃，12000g離心15min，棄上清，留沉淀 |
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試劑五（μL） |
300 |
300 |
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漩渦混勻，4℃，12000g離心10min，棄上清，留沉淀 |
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試劑五（μL） |
300 |
300 |
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漩渦混勻，4℃，12000g離心10min，棄上清，留沉淀 |
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試劑五（μL） |
300 |
300 |
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漩渦混勻，4℃，12000g離心10min，棄上清，留沉淀 |
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試劑六（μL） |
300 |
300 |
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漩渦混勻，37℃溫育15min，沉淀全部溶解后，4℃，12000g離心15min，取上清200μL于微量石英比色皿/96孔板中，測定A370。ΔA=A測定管-A對照管 |
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計算公式：
a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下
按照樣本蛋白濃度計算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr
按照樣本重量計算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量
按照液體體積計算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.227×ΔA370
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光系數(shù)，22 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，W：樣本質(zhì)量，g
1. 按照樣本蛋白濃度計算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr
2. 按照樣本重量計算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA370÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量
4. 按照液體體積計算
蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.454×ΔA370
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光系數(shù)，22 L/mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，W：樣本質(zhì)量，g
注意事項：
1. 試劑一使用前根據(jù)要測定的樣品數(shù)現(xiàn)配，配置好后4℃保存，若變?yōu)楹谏?，則不能使用。
2. 試劑二見光易分解，反應(yīng)需嚴(yán)格避光。
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資料/datasheet
