超氧陰離子(Oxygen free radical, OFR)試劑盒說明書
微量法100T/96S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
生物體內(nèi)超氧陰離子等活性氧具有免疫和信號(hào)傳導(dǎo)的作用，但積累過多時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞膜及生物大分子產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。
測(cè)定原理：
超氧陰離子與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2－，NO2－在對(duì)氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成紅色的偶氮化合物，在530nm處有特征吸收峰，根據(jù)ΔA值可以計(jì)算樣品中O2－含量，反應(yīng)式為NH2OH + 2O2－ ＋H＋ → NO2－ ＋ H2O2 ＋ H2O。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、氯仿和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體110mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑四：氯仿，自備。
超氧陰離子提取
測(cè)定操作表
|
|
空白管 |
測(cè)定管 |
|
樣本（μL） |
|
200 |
|
提取液（μL） |
200 |
|
|
試劑一(μL) |
160 |
160 |
|
混勻，37℃水浴20min |
||
|
試劑二（μL） |
120 |
120 |
|
試劑三（μL） |
120 |
120 |
|
混勻，37℃水浴20min |
||
|
試劑四（μL） |
200 |
200 |
|
混勻，8000g，25℃，離心5min，小心吸取上層水相200μL于微量石英比色皿/96孔板中，測(cè)定A530。ΔA=A測(cè)定-A空白，空白管只要做一管。 |
||
超氧陰離子含量計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0242x - 0.0027，R2=0.9980
1. 組織：
（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×2
=148.76×(ΔA+0.0027)÷W
超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T
=7.44× (ΔA+0.0027)÷W
（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算
超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷(V樣×Cpr)×2
=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr
超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T
=7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr
2. 細(xì)菌，真菌：
超氧陰離子含量（nmol/104 cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2
= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量
超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/104 cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T
=7.44× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量
3. 血清或培養(yǎng)液
超氧陰離子 含量（nmol/mL）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V反總÷V樣×2
=148.76× (ΔA+0.0027)
超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mL·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T
= 7.44× (ΔA+0.0027)
V樣總：加入提取液體積，1 mL； V反總：反應(yīng)總體積，0.36mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；2: 2分子O2－參與反應(yīng)生成1分子NO2－。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0121x - 0.0027，R2 = 0.9980
1. 組織：
（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
超氧陰離子含量（nmol/g 鮮重）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×2
=297.52× (ΔA+0.0027)÷W
超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ g·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷W÷T
=14.88× (ΔA+0.0027)÷W
（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算
超氧陰離子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V反總÷(V樣×Cpr)×2
=297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr
超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/ mg prot·min）= 297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr÷T
=14.88× (ΔA+0.0027)÷Cpr
2. 細(xì)菌，真菌：
超氧陰離子含量（nmol/104 cell）=(ΔA+0.0027)÷0.0121× V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×2
=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量
超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/104 cell·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量÷T
=14.88× (ΔA+0.0027)÷細(xì)胞數(shù)量
3. 血清或培養(yǎng)液
超氧陰離子 含量（nmol/mL）=(ΔA+0.0027)÷0.0121 ×V反總÷V樣×2
=297.52×(ΔA+0.0027)
超氧陰離子產(chǎn)生速率（nmol/mL·min）= 297.52×(ΔA+0.0027) ÷T
=14.88×(ΔA+0.0027)
V樣總：加入提取液體積，1 mL； V反總：反應(yīng)總體積，0.36mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.2mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；2：2分子O2－參與反應(yīng)生成1分子NO2－。
注意事項(xiàng)
掃描二維碼
掃描二維碼
資料/datasheet
可可.jpg)
