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游離脂肪酸含量(FFA)測(cè)試盒(比色法)
AS6321179
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產(chǎn)品詳情

游離脂肪酸(FFA)含量試劑盒(測(cè)血清、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞)

                                   微量法100管/96樣

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

游離脂肪酸,也稱(chēng)為非酯化脂肪酸,在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。動(dòng)物血液中的游離脂肪酸 (FFA )含量是一項(xiàng)重要的生理生化指標(biāo)。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類(lèi)代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān),游離脂肪酸的濃度會(huì)因?yàn)樘悄虿?、重癥肝障礙、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病而上升。

測(cè)定原理:

用有機(jī)溶劑萃取FFA。含有FFA的有機(jī)液與三乙醇胺銅反應(yīng),在有機(jī)相中形成脂肪酸銅 (銅皂) FFA一Cu。Cu離子與顯色液反應(yīng)形成紫紅色絡(luò)合物。反應(yīng)形成的顏色深淺與Cu離子濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾定律,因此可利用此反應(yīng)進(jìn)行比色。

自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、蒸餾水。

試劑的組成和配制:

萃取液:液體 120 mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體 15 mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:液體 15 mL×1瓶,4℃保存;

試劑三:粉劑×1瓶,室溫保存;

試劑四:液體 12 mL×1瓶,4℃保存;

樣本前處理:

1.動(dòng)物組織:按照動(dòng)物組織質(zhì)量(g):萃取液mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL萃取液),進(jìn)行冰浴勻漿。震蕩提取15min,5000 rpm 4℃離心5min,取有機(jī)相待測(cè)。

2.血清:吸取50 μL血清樣本,加入1 mL萃取液,震蕩提取15 min后,4℃,5000 rpm離心5 min,取有機(jī)相待測(cè)。

3.微生物、細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):萃取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1 mL萃取液)加入萃取液,冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲2秒,間隔3秒,總時(shí)間3min);震蕩提取15 min,然后5000 rpm 4℃離心5min,取有機(jī)相待測(cè)。

注意:有機(jī)相待測(cè)液可能存在于上層,也可能存在于下層,注意觀察,體積較多的那一層即為有機(jī)相待測(cè)液。

測(cè)定步驟:

  1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550 nm。
  2. 工作液的配制:臨用前根據(jù)用量按照試劑一(V):試劑二(V):試劑三(m)=1(mL):1(mL):0.66(g)的比例充分混勻。(注意:現(xiàn)用現(xiàn)配,用多少配多少,在空瓶中配制,試劑盒中帶有4個(gè)空瓶,先將試劑一與試劑二混合,最后再加入試劑三粉劑)

3、測(cè)定管:吸取600μL樣本,加入200μL工作液,蓋緊后震蕩20 min,4℃,5000 rpm離心5 min,分層后取200μL上層有機(jī)相,加入100μL試劑四,搖勻,10 min后測(cè)定550 nm的吸光值,記為A測(cè)定。

4、空白管:吸取600μL萃取液,加入200μL工作液,蓋緊后震蕩20 min,4℃,5000 rpm離心5 min,分層后取200μL上層有機(jī)相,加入100μL試劑四,搖勻,10 min后測(cè)定550 nm的吸光值,記為A空白。

空白管只需測(cè)一次?!鰽=A測(cè)定-A空白

注意:1、有機(jī)溶劑易揮發(fā),加入96孔板后應(yīng)盡快檢測(cè)。

2、測(cè)定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機(jī)相待測(cè)液。

 

FFA含量計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0161x - 0.0141     R2 = 0.9985   x:棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL)

                                            y:吸光值差值△A

 

1、血清FFA含量計(jì)算:

FFA含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000

                 =1.242×(△A+0.0141)

2、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞中FFA含量計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA含量(μmol/g鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(W× V1÷V2)÷1000

                =0.062×(△A+0.0141)÷W

(2)按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000

                =0.062×(△A+0.0141)÷Cpr

 

V1:加入樣本體積,0.6mL;V2:萃取液體積,1mL;V3:加入血清(漿)體積,0.05 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:動(dòng)物組織樣品質(zhì)量,g; 1000:1 μmol=1000 nmol 。

注意事項(xiàng):

蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機(jī)相待測(cè)液直接測(cè)定,可用蒸餾水或緩沖液或生理鹽水選用本公司的BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒。

最低檢出限為20 nmol/mL。

 

 

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