腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。
測(cè)定原理
AGP催化的逆向反應(yīng)生成G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測(cè)定NADPH增加速率，即可計(jì)算AGP活性。
需自備的的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存;
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入9mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
粗酶液制備
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、試劑一置30℃保溫10min以上。
3、在EP管中按順序加入下列試劑
|
試劑名稱（μL） |
測(cè)定管 |
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試劑一 |
50 |
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試劑二 |
80 |
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樣本 |
10 |
混勻，30℃保溫15 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻后，4000g4℃離心5min，取上清液，在96孔板中依次加入下列試劑
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上清液 |
80 |
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試劑一 |
85 |
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試劑三 |
35 |
混勻后，立即于340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
AGP活性計(jì)算
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
1、按樣本蛋白蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。
AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)
=2813×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數(shù)
=2813×ΔA÷W
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
1、按樣本蛋白蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。
AGP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)
=5627×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數(shù)
=5627×ΔA÷WV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。
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