β-淀粉酶（β-amylase，β-AL）試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100管/48樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
淀粉酶負(fù)責(zé)水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。
測(cè)定原理：
還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐熱。根據(jù)上述特性，鈍化其中之一，就可測(cè)出另一種淀粉酶的活力。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：30mL×1瓶，常溫保存，若有黃色晶體析出，需90℃加熱溶解后再用；
試劑二：15mL×1瓶，4℃保存，若出現(xiàn)沉淀析出，需70℃加熱溶解后再用。
粗酶液提取：
組織：稱取0.1~0.2g樣本（建議稱取約0.1g樣本），加入1mL蒸餾水，研磨勻漿；將勻漿倒入離心管中，提取液在室溫下放置提取15min，每5min振蕩1次，使其充分提??；3000g，25℃離心10min，取上清液加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，即淀粉酶原液。
吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于（α＋β）淀粉酶總活力的測(cè)定。
血清（漿）等液體樣本：（1）直接檢測(cè)α-淀粉酶。（2）吸取淀粉酶原液1mL，加入4mL蒸餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于（α＋β）淀粉酶總活力的測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540 nm，蒸餾水調(diào)零。
2、試劑一和試劑二40℃預(yù)熱10min.
3、測(cè)定操作表：
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試劑名稱（μL） |
α 淀粉酶活力測(cè)定 |
總淀粉酶活力測(cè)定 |
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對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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淀粉酶原液 |
75 |
75 |
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70℃水浴15min左右，冷卻
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淀粉酶稀釋液 |
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75 |
75 |
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蒸餾水 |
75 |
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75 |
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試劑二 |
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75 |
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75 |
40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min
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試劑一 |
150 |
150 |
150 |
150 |
混勻，95度水浴5min，冷卻，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm處讀取吸光值，從左到右分別記為A1、A2、A3和A4。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
酶活性計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸曲線為y=3.7215x -0.1778； x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、α 淀粉酶活性
（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
α 淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1.075×(A2-A1＋0.1778)÷W
（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
α 淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T
=0.1075×(A2-A1＋0.1778) ÷Cpr
（3）血清（漿）等液體樣本中α 淀粉酶活性計(jì)算
單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
α 淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T=0.1075×(A2-A1＋0.1778)
3、總淀粉酶活性計(jì)算
（1）按照樣品質(zhì)量計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
總淀粉酶活性(mg/min//g鮮重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=5.375×(A4-A3＋0.1778)÷W
（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
總淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T
=0.5375×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr
（3）血清（漿）等液體樣本中總淀粉酶活性計(jì)算
單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
總淀粉酶活性(mg/min/mL) =5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T
=0.5375×(A4-A3＋0.1778)
4、β-淀粉酶活性計(jì)算
（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
β-淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[5.375×(A4-A3＋0.1778)-1.075×(A2-A1＋0.1778)]÷W
（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr
（3）血清（漿）等液體樣本中β-淀粉酶活性計(jì)算
單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
β-淀粉酶活性（mg/min/mL）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)
5：總淀粉酶稀釋倍數(shù)；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.15mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075 mL；V樣總：提取液總體積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸曲線為y=2.481x -0.1778； x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、α 淀粉酶活性
（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
α 淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W
（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
α 淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr
（3）血清（漿）等液體樣本中α 淀粉酶活性計(jì)算
單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
α 淀粉酶活性（mg/min/mL）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷V樣÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778)
3、總淀粉酶活性計(jì)算
（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
總淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=8.06×(ΔA＋0.1778)÷W
（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
總淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T
=0.806×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr
（3）血清（漿）等液體樣本中總淀粉酶活性計(jì)算
單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
總淀粉酶活性(mg/min/mL)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反總]÷V樣÷T
=0.806×(A4-A3＋0.1778)
4、β-淀粉酶活性計(jì)算
（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
β-淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[8.06×(A4-A3＋0.1778)-1.612×(A2-A1＋0.1778)]÷W
（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。
β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=[0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr
（3）血清（漿）等液體樣本中β-淀粉酶活性計(jì)算
單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
β-淀粉酶活性（mg/min/mL）=淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性=0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)
5：總淀粉酶稀釋倍數(shù)；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.15mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075 mL；V樣總：提取液總體積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。
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