結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）
試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng)，主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。
測(cè)定原理
GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時(shí)生成ADP；進(jìn)一步通過(guò)反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH，其中NADPH生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP數(shù)量呈正比，通過(guò)340nm下測(cè)定NADPH的增加量，可以計(jì)算GBSS活性。
需自備的的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液：液體100mL×2瓶，4℃保存；
試劑一：40mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入14mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入8mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入10mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑五：液體×1支，-20℃保存；臨用前加入500μL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入500μL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
粗酶液制備
稱(chēng)取0.1~0.2g組織（建議稱(chēng)取約0.1g組織），加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心10min，棄上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混勻，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、在EP管中按順序加入下列試劑
|
試劑名稱(chēng)（μL） |
測(cè)定管 |
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樣本 |
75 |
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試劑二 |
135 |
混勻，30℃保溫20 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻
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試劑三 |
75 |
混勻，30℃保溫30 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 4℃離心10min，取上清液（如果一次性測(cè)定樣本較多，可以將試劑四、五和六按比例配成混合液）
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上清液 |
150 |
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試劑四 |
100 |
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試劑五 |
5 |
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試劑六 |
5 |
混勻后立即340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。
GBSS活性計(jì)算
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GBSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)
=529×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GBSS活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數(shù)=529×ΔA÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.075 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.9；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GBSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)
=1059×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
GBSS活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T×稀釋倍數(shù) =1059×ΔA÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.075 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.9；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。
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