?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acyl transferase，AAT）活性測定試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
AAT是一個多功能蛋白大家族，主要負責(zé)催化生物體內(nèi)各種?；腿ヵ；磻?yīng)，在基因表達、代謝和信號傳導(dǎo)中具有重要作用。
測定原理：
AAT催化乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙酰基到丁醇，釋放的CoA還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，測定412 nm吸光度增加速率可計算AAT活性。
自備儀器和用品：
研缽、冰、臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。
試劑三：粉劑×1支，4℃避光保存。
粗酶液提?。?/strong>
AAT測定操作：
1、分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調(diào)零。
2、工作液的配制：臨用前在試劑二瓶中加入18mL試劑一，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
3、試劑三的配制：臨用前加無水乙醇1mL充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存。
4、 空白管：在Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液，充分混勻，35℃反應(yīng)15min，加入10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置10min，測定412nm處吸光值，記為A空白管。
5、 測定管：在Ep管或96孔板中加入10μL樣本和180μL工作液，充分混勻，35℃反應(yīng)15min，加入10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置10min，測定412nm處吸光值，記為A測定管?！鰽=A測定管- A空白管，空白管只要做一管。
AAT活性計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按照蛋白濃度計算
活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（
×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（
×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T
= 98.04×△A÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（
×d）×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T
= 98.04×△A÷ 細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（
×d）×V反總÷V樣÷T
= 98.04×△A
：TNB消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑：1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，15 min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按照蛋白濃度計算
活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（
×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
=196.08×△A÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（
×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T
= 196.08×△A÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
活性單位定義：每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（
×d）×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T
=196.08×△A÷ 細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（
×d）×V反總÷V樣÷T
= 196.08×△A
：TNB消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：96孔板光徑：0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，15min。
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資料/datasheet
