肝酯酶（Hepatic lipase，HL）試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100T/48S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
肝酯酶是脂肪分解酶，在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中合成，存在于肝臟竇周間隙內(nèi)皮細(xì)胞表面和竇周間隙腔面的肝細(xì)胞微絨毛表面，可促進(jìn)脂蛋白中的膽固醇向類(lèi)固醇激素轉(zhuǎn)化，血漿中的HL活性增高時(shí)，血漿中小顆粒可導(dǎo)致LDL水平升高，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
測(cè)定原理
肝酯酶水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生α-萘酚，可與固藍(lán)B鹽形成紫紅色偶氮化合物，在595nm有特征吸收峰，顏色深淺在一定范圍內(nèi)與肝酯酶活性成正相關(guān)。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、冷凍離心機(jī)、研缽、水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。
試劑組成和配制
試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體8mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。
樣品處理
測(cè)定操作
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對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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樣品（μL） |
20 |
20 |
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試劑一（μL） |
90 |
80 |
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試劑二（μL） |
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10 |
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混勻，30℃水浴10min |
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試劑三（μL） |
80 |
80 |
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試劑四（μL） |
10 |
10 |
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充分混勻，30℃靜置5min，于微量石英比色皿/96孔板，測(cè)定595nm處吸光值，記為A對(duì)照管和A測(cè)定管，△A=A測(cè)定管- A對(duì)照管 |
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計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.1519 x -0.1241，R2=0.9994
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。
HL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 6.58×（△A+0.1241）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。
HL活性（μmol /min/g 鮮重）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T
= 6.58×（△A+0.1241）÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。
HL活性（μmol /min/104 cell）= （△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T
= 6.58×（△A+0.1241）÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。HL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.1241）÷0.1519×V反總÷V樣÷T
= 6.58×（△A+0.1241）
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min
b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.076 x -0.1241，R2=0.9994
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。
HL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 13.16×（△A+0.1241）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。
HL活性（μmol /min/g 鮮重）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T
= 13.16×（△A+0.1241）÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。
HL活性（μmol /min/104 cell）= （△A+0.1241）÷0.076×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T
= 13.16×（△A+0.1241）÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol α-萘酚為一個(gè)酶活力單位。HL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.1241）÷0.076×V反總÷V樣÷T
= 13.16×（△A+0.1241）
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min
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