乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100管/48樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
ACC在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
測(cè)定原理
ACC能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰輔酶A、ATP和無(wú)機(jī)磷，通過(guò)鉬酸銨定磷法測(cè)定無(wú)機(jī)磷的增加量來(lái)測(cè)定ACC活性。
需自備的儀器和用品
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：10mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑六：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑七：10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。
樣本的前處理
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
3、定磷試劑的配制：按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑
應(yīng)為淺黃色，若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑七20倍稀釋，即取 0.5mL試劑七加9.5蒸餾水，充分混勻。
5、酶促反應(yīng)
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試劑名稱（μL） |
對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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試劑一 |
90 |
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試劑二 |
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50 |
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試劑三 |
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40 |
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樣本 |
10 |
10 |
37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，90℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清
6、定磷
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標(biāo)準(zhǔn)管 |
空白管 |
對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液 |
20 |
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蒸餾水 |
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20 |
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上清液 |
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20 |
20 |
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定磷試劑 |
180 |
180 |
180 |
180 |
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）保溫30min，冷卻至室溫，在 660nm處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值A(chǔ)。標(biāo)準(zhǔn)管、空白管只要做一次即可，每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
注意：若測(cè)定管吸光值大于2，將樣品用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測(cè)定，使吸光值小于2，可提高檢測(cè)靈敏度，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
ACC活性計(jì)算：
1、按組織蛋白濃度計(jì)算：
定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。
ACC (μmol/h/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷
(V樣×Cpr)÷T=10×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算：
定義：每小時(shí)每g組織產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。
ACC (μmol/h /g鮮重)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷
(W× V樣÷V樣總)÷T=10×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
定義：每小時(shí)每500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。
ACC (U/104 cell)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷
(500× V樣÷V樣總)÷T=0.02×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
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