脂蛋白酯酶（Lipoprotein lipase，LPL）試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/48S
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
脂蛋白酯酶是脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成的一種酶，可催化甘油三脂水解為脂肪酸和單酸甘油酯，以供組織氧化供能和貯存，并在不同的組織表現(xiàn)出不同的生理意義。
測(cè)定原理
脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕櫚酸酯產(chǎn)生4-硝基苯酚，在400nm有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、冷凍離心機(jī)、研缽、水浴鍋、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。
試劑組成和配制
試劑一：液體105mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體4mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。
樣品處理
測(cè)定操作
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對(duì)照管 |
測(cè)定管 |
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樣品（μL） |
20 |
20 |
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試劑一（μL） |
80 |
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試劑二（μL） |
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80 |
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混勻，45℃水浴10min |
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試劑三（μL） |
100 |
100 |
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充分混勻，25℃靜置2min，于微量石英比色皿/96孔板，測(cè)定400nm處吸光值，記為A對(duì)照管和A測(cè)定管，△A=A測(cè)定管- A對(duì)照管 |
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計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.0581x -0.0169，R2=0.9982
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。
LPL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.0169）÷ 0.0581×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 17.21×（△A+0.0169）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。
LPL活性（μmol /min/g 鮮重）=（△A+0.0169）÷0.0581×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T
= 17.21×（△A+0.0169）÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。
LPL活性（μmol /min/104 cell）= （△A+0.0169）÷0.0581×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T
= 17.21×（△A+0.0169）÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫升血清每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。
LPL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.0169）÷0.0581×V反總÷V樣÷T
= 17.21×（△A+0.0169）
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min
b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.029x -0.0169，R2=0.9982
1．按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。
LPL活性（μmol /min/mg prot）= （△A+0.0169）÷ 0.029×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 34.42×（△A+0.0169）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每克組織每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。
LPL活性（μmol /min/g 鮮重）=（△A+0.0169）÷0.029×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T
= 34.42×（△A+0.0169）÷W
3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。
LPL活性（μmol /min/104 cell）= （△A+0.0169）÷0.029×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T
=34.42×（△A+0.0169）÷細(xì)胞數(shù)量
4．按照液體體積計(jì)算
酶活性定義：在45℃，pH7.5條件下，每毫升血清每分鐘水解產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚為一個(gè)酶活力單位。
LPL活性（μmol /min/mL）=（△A+0.0169）÷0.029×V反總÷V樣÷T
= 34.42×（△A+0.0169）
V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min
注意事項(xiàng)
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