植酸酶（phytase）試劑盒說明書
微量法100T/48S
注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義
植酸酶（phytase）是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸（鹽）的一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶，它能將食品和飼料中植酸及其鹽轉(zhuǎn)化為可供有機體利用的有效磷，降低糞便中的磷含量，減輕對環(huán)境的污染，改善營養(yǎng)成分的吸收和利用，因此具有極其廣泛的研究和應用價值。
測定原理
植酸酶在一定溫度和pH值條件下，水解底物植酸鈉生成無機磷與肌醇衍生物，無機磷在酸性環(huán)境中與鉬酸銨顯色劑反應生成藍色復合物，在700nm處有特征吸收峰，根據(jù)700nm處吸光值變化可計算得植酸酶活性。
自備實驗用品及儀器
天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋，超聲溶解器，回旋式振蕩器。
試劑組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
緩沖液：液體15mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加緩沖液6mL配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；用不完的試劑4℃保存一個月。
試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存。
顯色劑：粉劑×8瓶，4℃保存，臨用前根據(jù)用量每瓶加0.4mL雙蒸水溶解，再加1.6mL試劑二混勻。
樣本處理
測定操作表
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對照管 |
測定管 |
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樣本（μL） |
30 |
30 |
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37℃溫育5min |
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緩沖液（μL） |
120 |
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試劑一（μL） |
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120 |
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混勻，37℃溫育30min |
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95℃，10min終止反應，冷卻至室溫 |
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顯色劑（μL） |
150 |
150 |
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混勻，37℃靜置15min，10000g，室溫，離心5min，取上清200μL，測定700nm處吸光值，△A=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。 |
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酶活性計算公式
標準曲線：y = 0.2764x + 0.0082，R2 = 0.9998；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值。
酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每毫克蛋白每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無機磷為一個酶活力單位。
植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0082）÷0.2764÷Cpr÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷Cpr2．按照樣本質(zhì)量計算
酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每克樣本每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無機磷為一個酶活力單位。
植酸酶活性（μmol/min /g 鮮重）=（△A-0.0082）÷0.2764÷W÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷W
3. 培養(yǎng)液等液體樣品
酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每毫升液體每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無機磷為一個酶活力單位。
植酸酶活性（μmol/min /mL）=（△A-0.0082）÷0.2764÷T =0.1206×（△A-0.0082）
Cpr：樣本蛋白含量，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，30min。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.1382x + 0.0082，R2 = 0.9998；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計算
酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每毫克蛋白每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無機磷為一個酶活力單位。
植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0082）÷0.1382÷Cpr÷T = 0.2412×（△A-0.0082）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計算
酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每克樣本每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無機磷為一個酶活力單位。
植酸酶活性（μmol/min /g 鮮重）=（△A-0.0082）÷0.1382÷W÷T =0.2412×（△A-0.0082）÷W
3. 培養(yǎng)液等液體樣品
酶活性定義：在37℃，pH5.5的條件下，每毫升液體每分鐘從5mmol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol的無機磷為一個酶活力單位。
植酸酶活性（μmol/min /mL）=（△A-0.0082）÷0.1382÷T =0.2412×（△A-0.0082）
Cpr：樣本蛋白含量，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，30min。
注意事項
1、顯色劑需要臨用前根據(jù)用量配制，每一瓶是13個樣本的用量，新配制的顯色劑若有顏色則已經(jīng)污染或者試劑過期，應放棄使用。
2、ΔA線性范圍為0.01-1。
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資料/datasheet
