脫氫酶（dehydrogenase, DHA）試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義
脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶，催化底物通過細(xì)胞色素系統(tǒng)被氧化，釋放的能量供機體使用，是生物體取得能量的一種方式。
測定原理
在細(xì)胞呼吸過程中，氫受體2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈現(xiàn)紅色，于485nm測定其吸光值，即得脫氫酶活性。
自備實驗儀器及用品
篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請用戶自備）。
試劑的組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存
試劑一：粉劑×1瓶，使用前加10mL試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。
試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：甲醇，自備。
樣品處理
測定步驟和操作表
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空白管 |
測定管 |
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樣品（μL） |
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100 |
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蒸餾水（μL） |
100 |
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試劑一（μL） |
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100 |
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試劑二（μL） |
100 |
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充分混勻，37℃培養(yǎng)24h |
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試劑三（μL） |
900 |
900 |
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振蕩1h，8000g，25℃，離心5min，取200μL上清于微量石英比色皿/96孔板，測定A485，△A=A測定-A空白管?？瞻坠苤灰鲆还?。 |
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脫氫酶活力計算
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R2 = 0.9988；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計算
酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W
3. 按液體體積計算
酶活單位定義：在37℃時，每mL樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷V樣÷T= 0.181×（△A+0.0312）
V反總：反應(yīng)總體積，1.1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；T：培養(yǎng)時間，1d=1440min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0211x - 0.0312；R2 = 0.9988；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計算
酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷W
3. 按液體體積計算
酶活單位定義：在37℃時，每mL樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。
DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷V樣÷T= 0.362×（△A+0.0312）
V反總：反應(yīng)總體積，1.1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；T：培養(yǎng)時間，1d=1440min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。
注意事項：
配制好的試劑一避光保存于4℃，最好在一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。
掃描二維碼
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資料/datasheet
