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琥珀酸脫氫酶(SDH)測(cè)試盒(比色法)
AS6321142
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產(chǎn)品詳情

  琥珀酸脫氫酶(Succinate Dehydrogenase,SDH)試劑盒說明書

                                          微量法 100管/96樣

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

SDH(EC 1.3.5.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。SDH是線粒體的一種標(biāo)志酶,位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶,是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。此外,為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

測(cè)定原理

SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸(PMS)傳遞還原2,6-二氯酚靛酚(DCPIP),并且在600nm處具有特征吸收峰,通過600nm吸光度的變化,測(cè)定2.6-DPIP的還原速度,代表SDH酶活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:100mL×1瓶,-20℃保存;

試劑二:20mL×1瓶,-20℃保存;

試劑三:1.5mL×1支,-20℃保存;

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存;

試劑五:粉劑×1支,-20℃保存;

樣本的前處理

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

  1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
  2. 將勻漿600g,4℃離心5min。
  3. 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
  4. 上清液即胞漿提取物,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的SDH(此步可選做)。
  5. 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體SDH活性測(cè)定。

測(cè)定步驟和加樣表

  1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm,蒸餾水調(diào)零。
  2. 樣本測(cè)定

(1)在試劑四中加入18mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴10min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

(2)在試劑五中加入1mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL試劑四,混勻,立即記錄600nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和 1min20s后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。

SDH活性的計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 SDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣) ÷T=952×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 SDH活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),2.1×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

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