羥甲基戊二酰輔酶A合成酶（HMGCS）試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
羥甲基戊二酰輔酶A合成酶是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA。
測(cè)定原理
HMGCS催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA，同時(shí)產(chǎn)生CoASH，使DTNB轉(zhuǎn)化為黃色的TNB，在412nm下有特征吸光值。
所需的儀器和用品
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：粉劑×1瓶，-20℃避光保存；臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存；臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑三：6mL×1瓶，4℃避光保存。
樣本測(cè)定的準(zhǔn)備
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟
HMGCS活性計(jì)算
用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）活性
單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。
HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣 ÷T=36.76×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞HMGCS活性
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。
HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=36.76×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。
HMGCS（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=36.76×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。
HMGCS（nmol/min /104 cel）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.074×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，4 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）活性
單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。
HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣 ÷T=73.53×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞HMGCS活性
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。
HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=73.53×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。
HMGCS（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=73.53×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolTNB為一個(gè)酶活力單位。
HMGCS（nmol/min /104 cel）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.147×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×104 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，4 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
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資料/datasheet
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