還原糖含量試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
還原糖廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。植物體內(nèi)的還原糖主要包括葡萄糖、果糖和麥芽糖等，是最常見的單糖和雙糖，其中葡萄糖和果糖不僅是呼吸作用的主要底物，也是進一步合成蔗糖、淀粉和纖維素的底物。
測定原理：
加熱促進堿性溶液中3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖生成棕紅色氨基化合物，在540nm有特征吸收峰；在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖含量與540nm吸光度成線性關(guān)系，根據(jù)標準曲線，即可求出樣品中還原糖的量。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：8mL×1瓶 ，4℃保存；
樣品中還原糖的提?。?/p>
1、細菌或細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復30次），轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測定用。
2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g 吧，25℃離心10min，取上清供測定用。
3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時水分散失），80℃水浴中40min并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測定用。
測定步驟：
|
試劑（μL） |
對照管 |
測定管 |
|
樣本 |
175 |
175 |
|
試劑二 |
|
125 |
|
蒸餾水 |
125 |
|
混勻，在95℃水浴中加熱5min（蓋緊，防止水分散失），取出后立即冷卻至室溫，混勻。取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm波長下讀取對照管和測定管吸光值。計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。
注意：如果ΔA大于2，需要將樣本用試劑一稀釋，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)（若顯色后出現(xiàn)分層現(xiàn)象，可改用蒸餾水稀釋）。
還原糖含量計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、標準條件下測定回歸方程為y = 8.3796x- 0.3034；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按樣本鮮重計算：
還原糖(μg/g鮮重)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(W×V1÷V2)=119.34×(ΔA＋0.3034)÷W
3、按樣本蛋白濃度計算：
還原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(V1×Cpr)=119.34×(ΔA＋0.3034)÷Cpr
4、按細菌或細胞密度計算：
還原糖(μg /104 cell)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（500×V1÷V2）=0.239×(ΔA＋0.3034)
5、按血清（漿）體積計算：
還原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（V3×V1÷V2）=1193.4×(ΔA＋0.3034)
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入樣本體積，0.175mL；V2：加入試劑一體積，1 mL；V3：加入血清（漿體積），0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、標準條件下測定回歸方程為y = 4.1898x - 0.3034， R2 = 0.9997；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按樣本鮮重計算：
還原糖(μg/g鮮重)＝[1000×(ΔA＋0.3034)÷4.1898×V1]÷(W×V1÷V2)=238.67×(ΔA＋0.3034)÷W
3、按樣本蛋白濃度計算：
還原糖（μg/mg prot）= [1000×(ΔA＋0.3034)÷4.1898×V1]÷(V1×Cpr)=238.67×(ΔA＋0.3034)÷Cpr
4、按細菌或細胞密度計算：
還原糖（μg/104 cell）= [1000×(ΔA＋0.3034)÷4.1898×V1]÷（500×V1÷V2）=0.477×(ΔA＋0.3034)
5、按血清（漿）體積計算：
還原糖（μg/mL）＝[1000×(ΔA＋0.3034)÷4.1898×V1]÷（V3×V1÷V2）=2386.7×(ΔA＋0.3034)
1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入樣本體積，0.175mL；V2：加入試劑一體積，1 mL；V3：加入血清（漿體積），0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
注意：最低檢測限為1mg/g鮮重或10μg/mg prot
掃描二維碼
掃描二維碼
資料/datasheet
