內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性測定試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
Cx（EC3.2.1.4）存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi)，是纖維素酶系的組份之一，Cx主要作用于非晶態(tài)纖維素和水溶性纖維素衍生物，隨機(jī)水解糖苷鍵，將其分解成葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和其他寡聚體。
測定原理：
采用3,5－二硝基水楊酸法測定Cx催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。
需自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀/可見分光光度計(jì)、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體25mL×1瓶，4℃保存；
樣品測定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
2、加樣表（在EP管中依次加入下列試劑）：
|
試劑名稱（μL） |
測定管 |
對照管 |
|
樣本 |
10 |
10 |
|
試劑一 |
100 |
|
|
蒸餾水 |
|
100 |
混勻，37℃準(zhǔn)確水浴2h
|
試劑二 |
200 |
200 |
混勻， 90℃水浴10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，測540nm下吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A測定管-A對照管。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。
Cx活性計(jì)算
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 6.4078x - 0.0673；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、血清（漿）Cx活力的計(jì)算
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
Cx活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷V樣÷T
=14.305×(ΔA+0.0673)
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中Cx活力的計(jì)算
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
Cx活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T
=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
Cx活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T
=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
Cx活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=0.0286×(ΔA+0.0673)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.11mL； V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 3.2039x - 0.0673；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、血清（漿）Cx活力的計(jì)算
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
Cx活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷V樣÷T
=28.61×(ΔA+0.0673)
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中Cx活力的計(jì)算
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
Cx活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T
=28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
Cx活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T
=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
Cx活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=0.057×(ΔA+0.0673)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.11mL； V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
掃描二維碼
掃描二維碼
資料/datasheet
