β－葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase，β-GD）試劑盒說明書
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義
β-GD廣泛存在于動(dòng)物組織中，是一種參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程的基質(zhì)降解酶，具有水解固醇葡萄糖醛酸和酸性粘多糖等生理功能。該酶在肝細(xì)胞中含量較高。此外在胃癌組織中含量豐富，測(cè)定胃液β-GD活性對(duì)于研究胃癌具有重要的意義。
測(cè)定原理
β-GD催化苯酚 β-D-葡萄糖醛酸產(chǎn)生游離的酚酞，通過測(cè)定苯酚含量反應(yīng)該酶活性高低。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體2mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑仍-20℃保存；
試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存；
試劑四：1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10mL，4℃保存；
樣品測(cè)定的前處理
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
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試劑名稱（μL） |
加樣孔 |
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測(cè)定管 |
標(biāo)準(zhǔn)管 |
空白管 |
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試劑一 |
20 |
20 |
20 |
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試劑二 |
20 |
20 |
20 |
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樣本 |
10 |
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1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液 |
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10 |
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蒸餾水 |
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10 |
混勻后，37℃反應(yīng)30min
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試劑三 |
150 |
150 |
150 |
混勻， 540nm下測(cè)定各管吸光值
注意：標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測(cè)一次。
β-GD活性計(jì)算
（1）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每小時(shí)每g鮮重樣品中催化產(chǎn)生 1μmol酚酞的量為一個(gè)活力單位。
β-GD（μmol/h/g 鮮重）= (C標(biāo)準(zhǔn)管×V1)×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=2×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每小時(shí)每mg組織蛋白催化產(chǎn)生 1μmol酚酞的量為一個(gè)活力單位。
β-GD（μmol/h/mg prot）= (C標(biāo)準(zhǔn)管×V1)×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=2×（A測(cè)定管-A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr
C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度， 1μmol/mL；V1：加入樣本體積：0.01mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
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