總糖含量試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100管/96樣
正式測(cè)定前請(qǐng)選擇2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
糖類(lèi)物質(zhì)是構(gòu)成植物體的重要組成成分之一，也是新陳代謝的主要原料和貯存物質(zhì)。總糖也可稱(chēng)為碳水化合物，包括可溶性的單糖，二糖以及不溶性的淀粉，纖維素，幾丁質(zhì)等。
測(cè)定原理：
總糖酸水解為還原糖，在NaOH和丙三醇存在下，DNS試劑與還原糖共熱后被還原成氨基化合物，在過(guò)量的NaOH堿性溶液中呈桔紅色，在540nm處有最大吸收峰，以此測(cè)定樣品中的總糖含量。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、沸水浴、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體100mL×1瓶 ，4℃保存；
試劑三：液體5mL×1瓶 ，4℃避光保存；
樣品中總糖的提?。?/p>
組織：稱(chēng)取約0.1g樣品，加入1mL 試劑一，1.5mL蒸餾水，勻漿，95℃水浴中加熱30min，加入1mL試劑二，混勻，用蒸餾水定容至10mL，8000g 25℃離心10min，取上清液待測(cè)。（注意稀釋?zhuān)?jiàn)注意事項(xiàng)）
液體樣本：取0.1mL樣本，加入1mL 試劑一，1.5mL蒸餾水，勻漿，95℃水浴中加熱30min，加入1mL試劑二，8000g 25℃離心10min，取上清液待測(cè)。（注意稀釋?zhuān)?jiàn)注意事項(xiàng)）
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、調(diào)節(jié)水浴鍋至95度。
3、加樣表：
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試劑（μL） |
空白管 |
測(cè)定管 |
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樣本 |
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8 |
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蒸餾水 |
16 |
8 |
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試劑三 |
12 |
12 |
混勻，置95度水浴中10min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻至室溫
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蒸餾水 |
172 |
172 |
混勻，540nm測(cè)定吸光值，ΔA=A測(cè)定管-A空白管
注意：1、空白管只要做一管。
2、如果ΔA大于2，需要將上清液用蒸餾水稀釋?zhuān)?jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
總糖含量計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.3002x - 0.0507；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按樣本鮮重計(jì)算：
總糖（mg /g鮮重）= [(ΔA＋0.0507) ÷0.3002×V1]÷（W×V1÷V2）×稀釋倍數(shù)=33.311×(ΔA＋0.0507) ÷W×稀釋倍數(shù)。
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
總糖（mg /mg prot）=[(ΔA＋0.0507) ÷0.3002×V1]÷(V1×Cpr) ×稀釋倍數(shù)=3.3311×(ΔA＋0.0507) ÷Cpr×稀釋倍數(shù)。
V1：加入樣本體積，0.008mL；V2：加入提取液體積，10mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
4、按照液體體積計(jì)算：
總糖（mg /mL）=[(ΔA＋0.0507) ÷0.3002×V1]÷（V3×V1÷V2）×稀釋倍數(shù)=116.59×(ΔA＋0.0507)×稀釋倍數(shù)。
V1：加入樣本體積，0.008mL；V2：加入提取液體積，10mL/3.5mL； V3:液體樣本，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
注意：最低檢測(cè)限為1mg/g鮮重或10ng/mg prot
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