α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase, α-GAL）試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，能專一地催化α半乳糖苷鍵的水解，主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL對于植物種子的萌發(fā)至關(guān)重要，種子萌發(fā)初期，其催化產(chǎn)生的D-半乳糖通過糖酵解途徑迅速轉(zhuǎn)化和消耗，為種子的萌發(fā)提供最初的能量來源，后期則主要參與細胞壁儲藏多糖水解。
測定原理：
α-GAL分解對-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算α-GAL活性。
自備用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2.5mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。
試劑二：液體4mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體13mL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提?。?/p>
1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
2、樣本測定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）：
|
試劑名稱（μL） |
測定管 |
對照管 |
|
試劑一 |
25 |
|
|
蒸餾水 |
|
25 |
|
試劑二 |
35 |
35 |
|
樣本 |
10 |
10 |
迅速混勻，放入37℃保溫30min
|
試劑三 |
130 |
130 |
充分混勻， 400nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設一個對照管。
α-GAL活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.00585x -0.0027；x為標準品濃度（nmol/mL），y為吸光值。
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-GAL活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.08×(ΔA +0.0027)
V反總：反應體系總體積，0.07mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；T：反應時間，30min。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027；x為標準品濃度（nmol/mL），y為吸光值。
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-GAL活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。
α-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.12×(ΔA +0.0027)
V反總：反應體系總體積，0.07mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；T：反應時間，30min。
掃描二維碼
掃描二維碼
資料/datasheet
